[發明專利]一種產琥珀酸放線桿菌基因敲除方法

有效

• 申請號: 201711156168.1
• 申請日: 2017-11-20
• 公開（公告）號: CN107916247B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 姜岷;朱君如;信豐學;章文明;董維亮;馬江鋒
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/65;C12R1/01
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓;尹妍

本發明公開了一種產琥珀酸放線桿菌基因敲除方法。通過構建目的基因左右同源臂；構建帶有抗生素篩選標記及負篩選標記的自殺質粒；將目的基因左右同源臂連接自殺質粒，并轉入供體菌感受態細胞中，通過抗性平板涂布篩選正確的陽性單克隆并測序驗證；將正確的陽性單克隆轉入目的菌株產琥珀酸放線桿菌，在抗性平板中篩選發生單交換的陽性單克隆，將發生正確單交換的陽性單克隆進行負篩選得到缺失目的基因的重組菌株。本發明的方法針對產琥珀酸放線桿菌敲除目的基因，其操作過程簡單，轉化效率高，適用于多基因敲除，且能夠實現目的基因的無痕敲除。

技術領域

本發明涉及基因工程及代謝工程改造領域，具體涉及一種產琥珀酸放線桿菌高效基因敲除方法。

背景技術

琥珀酸(又稱丁二酸(Succinic acid))是一種常見的天然有機酸，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中。作為一種重要的化工原料，它在醫藥、食品以及表面活性劑等行業也有著廣泛的用途。琥珀酸可作為合成復雜有機化合物的中間體，也可以作為C₄平臺化合物用于合成大宗化學品以及生物可降解材料，因此琥珀酸被認為是繼檸檬酸后最具市場潛力的發酵有機酸產品。

傳統的琥珀酸化學合成法采用丁烷經順丁烯二酸酐通過電解生產，存在成本高和環境污染等問題，限制了其作為基本化工原料的廣泛應用。生物法生產琥珀酸是以可再生碳源(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等)和CO₂作為主要原料，通過菌株發酵生產琥珀酸，因此新工藝本身不僅擺脫了對石化原料的依賴，而且開辟了對溫室氣體CO₂利用的新途徑。一旦實現了丁二酸發酵的大規模生產，就可以以丁二酸取代一些石油化工產品，而成本的降低更有利于該產品的廣泛應用，社會、環境效益更加顯著。

目前，琥珀酸工業發酵菌株的研究主要集中在產琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)，產琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)，谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)和大腸桿菌(Escherichiacoli)等。其中在琥珀酸的發酵生產中，產琥珀酸放線桿菌因其具有耐高底物、產物濃度，高產琥珀酸，碳源廣泛等優點已成為目前最具產業化生產前景的琥珀酸生產菌株。從自然界篩選獲得的野生型菌株在琥珀酸的合成過程中，往往會伴有副產物的生成，因此須采用基因工程及代謝工程技術對產琥珀酸放線桿菌進行代謝工程改造以獲得生產性能優良且適用于工業化生產的琥珀酸生產菌株。

發明內容

本發明的目的在于建立一種產琥珀酸放線桿菌高效基因敲除方法，為A.succinogenes屬菌株提供高效的遺傳操作平臺，利用該遺傳操作平臺對產琥珀酸放線桿菌進行代謝工程改造以獲得生產性能優良且適用于工業化生產的琥珀酸生產菌株。

為了實現本發明的目的，本發明采用了以下技術方案：

一種產琥珀酸放線桿菌基因敲除方法，包括如下步驟：

(1)構建目的基因左右同源臂，并測序驗證；

(2)構建帶有抗生素篩選標記及負篩選標記的自殺質粒；

(3)將目的基因左右同源臂連接自殺質粒，并轉入供體菌感受態細胞中，通過抗性平板涂布篩選正確的陽性單克隆并測序驗證；

(4)將正確的陽性單克隆轉入目的菌株產琥珀酸放線桿菌，在抗性平板中篩選發生單交換的陽性單克隆，將發生正確單交換的陽性單克隆進行負篩選得到缺失目的基因的重組菌株。

本發明的方法，所述步驟(1)中，同源左臂和同源右臂片段大小為1500bp-2000bp。優選通過融合PCR的方式構建目的基因左右同源臂。在琥珀酸放線桿菌中如果要進行基因敲除，同源左臂及同源右臂的片段大小選擇1500-2000bp的范圍之中，可提高基因敲除效率。