[發明專利]一種產琥珀酸放線桿菌基因敲除方法有效
| 申請號： | 201711156168.1 | 申請日： | 2017-11-20 |
| 公開（公告）號： | CN107916247B | 公開（公告）日： | 2020-12-08 |
| 發明（設計）人： | 姜岷;朱君如;信豐學;章文明;董維亮;馬江鋒 | 申請（專利權）人： | 南京工業大學 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N15/74;C12N15/65;C12R1/01 |
| 代理公司： | 江蘇致邦律師事務所 32230 | 代理人： | 徐蓓;尹妍 |
| 地址： | 211816 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 琥珀酸 放線 桿菌 基因 方法 | ||
【權利要求書】：
1.一種產琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)基因敲除方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)構建目的基因左右同源臂，并測序驗證；同源左臂和同源右臂片段大小為1500bp-2000bp；
(2)構建帶有氯霉素抗性基因Cat、蔗糖負篩選標記基因SacB的自殺質粒pJC4；
(3)將目的基因左右同源臂通過一步克隆的方式連接自殺質粒pJC4的SacⅠ酶切位點，并轉入供體菌感受態細胞中，通過氯霉素抗性平板涂布篩選正確的陽性單克隆并測序驗證，氯霉素篩選濃度為25ug/mL；
(4)將正確的陽性單克隆轉入目的菌株產琥珀酸放線桿菌，在氯霉素抗性平板中篩選發生單交換的陽性單克隆，氯霉素篩選濃度為5ug/mL，將發生正確單交換的陽性單克隆涂布在蔗糖平板進行負篩選得到缺失目的基因的重組菌株，蔗糖濃度為平板體積的10％。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，通過融合PCR的方式構建目的基因左右同源臂。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，通過接合轉移的方式將正確的陽性單克隆轉入目的菌株產琥珀酸放線桿菌。
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