[發明專利]一種用于莖環引物-滾環擴增反應的莖環引物以及莖環引物-滾環擴增的應用

有效

• 申請號: 201711156103.7
• 申請日: 2017-11-20
• 公開（公告）號: CN107760763B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 王進科;張貝貝
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

本發明公開了一種用于莖環引物?滾環擴增反應的莖環引物以及莖環引物?滾環擴增的應用，該莖環引物為一種具有雙鏈莖部和單鏈環區的單分子鏈內發卡結構，通過莖環引物進行莖環引物?滾環擴增可以對核酸分子進行檢測。本發明通過在滾環擴增反應中使用莖環引物開發了一種創新性的滾環擴增方法。該滾環擴增方法在核酸檢測中具有卓越和獨特的優點，包括在液相和固相中的靈活性檢測、高通量和高靈敏度，在容易實現的恒定反應條件下進行自控的線性或指數擴增，并且可以在溶液中均相和快速地檢測靶核酸分子。本發明莖環引物?滾環擴增方法克服了目前滾環擴增方法中的幾乎所有的局限性。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于莖環引物-滾環擴增反應的莖環引物以及莖環引物-滾環擴增在核酸分子檢測中的應用。

背景技術

核酸分子的檢測是醫學、農業、環境、戰爭、檢疫、獸醫等領域無法避免的常用生物分子檢測技術，也是生命科學基礎研究中非常常見且不可避免的常用生物分子檢測技術。因此，為了滿足這些領域中對各種目的各類核酸分子的檢測需求，科學家及工程技術人員發明了各色核酸檢測分析技術，如最常見的聚合酶鏈式反應(PCR)、各式核酸等溫擴增技術(如滾環擴增技術(RCA)、LAMP、NASBA等)、核酸雜交檢測技術(如Southern blot，DNA微陣列芯片技術等)。本發明亦屬于可用于上述領域的新的核酸檢測分析技術之一。

在各種核酸分析中，聚合酶鏈反應(PCR)是最流行的擴增方法。然而，PCR具有以下幾個缺點：(1)PCR反應需要昂貴的熱循環反應器。(2)PCR擴增產物相對較短。(3)PCR容易受到假陽性的影響。(4)PCR在多重核酸檢測中具有有限的適用性。滾環擴增(RCA)可以克服PCR的上述缺點。因此，RCA作為等溫核酸擴增技術引起了相當大的關注，并且經常用于靈敏地檢測核酸，蛋白質等。RCA是一種簡單方便的技術，利用聚合酶(如Phi29，BstDNA聚合酶及T7RNA聚合酶)和環形模板來精確產生含有大量串聯重復序列的長單鏈DNA或RNA。

RCA包括兩種擴增方式，線性RCA(1RCA)和指數RCA(eRCA)。前者通過延長環模板上的單個引物實現擴增，從而生成與環模板互補并具有大量重復序列的單鏈DNA。相比之下，1RCA在nM-pM水平上有較低的檢測度。為了獲得更廣泛的應用，應提高RCA的靈敏度。隨后，RCA方法被改進以提高靈敏度和擴增效率。在lRCA的基礎上，通過使用多重引物發明了eRCA。根據引物的設計，有兩種主要的eRCA擴增方式。一個是多個引物與相同的環形模板直接互補進行擴增。該方法的擴增效率主要取決于被環模板和引物長度所影響的引物的數量。因此，環模板和引物的長度是該方法的限制因素。另一種是超支化RCA(hbRCA)，其使用與1RCA的擴增產物互補的一個或多個引物，下一組引物與上一步擴增的新產物互補進行后續擴增。HbRCA可以在短時間內產生大量的環拷貝(10⁹或更多拷貝，90分鐘)，這使其靈敏度非常顯著。

RCA檢測可以在溶液(液相)和固體載體(固相)中進行。液相1RCA一般通過使特定的鎖式探針與其靶標退火，用連接酶環化，并用與鎖式探針互補的通用引物延伸而實現。液相eRCA一般通過hbRCA，RCA產物生成多個環和使用切刻酶切割產生引物來實現。然而，主要由于需要連接反應，這些現有的各種液相RCA不能實現均相(homogeneous)檢測。RCA也適用于固相檢測(稱為固相RCA，spRCA)。如果RCA引物直接或間接連接在固體載體上，RCA產物將被固定在固體支持物上。由RCA反應產生的放大信號因此可以位于特定位置。