[發(fā)明專利]一種用于莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應的莖環(huán)引物以及莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增的應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711156103.7
• 申請日: 2017-11-20
• 公開（公告）號: CN107760763B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發(fā)明（設計）人: 王進科;張貝貝
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

1.一種用于莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應的莖環(huán)引物，其特征在于，所述莖環(huán)引物為一種具有雙鏈莖部和單鏈環(huán)區(qū)的單分子鏈內發(fā)卡結構；所述莖環(huán)引物包括第一莖環(huán)引物分子和第二莖環(huán)引物分子，指數(shù)滾環(huán)擴增使用第一莖環(huán)引物分子和第二莖環(huán)引物分子； 第一莖環(huán)引物分子的單鏈環(huán)區(qū)可與核酸分子雜交，雜交導致其雙鏈莖部解鏈，暴露出3′ 端單鏈區(qū)；該單鏈區(qū)再與滾環(huán)模板雜交，從而啟動線性滾環(huán)擴增反應得到線性滾環(huán)擴增反應產物；所述第二莖環(huán)引物分子的單鏈環(huán)區(qū)可與線性滾環(huán)擴增反應產物雜交，雜交導致其雙鏈莖部解鏈，暴露出3′ 端單鏈區(qū)；該單鏈區(qū)再與滾環(huán)模板雜交，從而啟動指數(shù)滾環(huán)擴增反應。

2.根據(jù)權利里要求1所述的莖環(huán)引物，其特征在于，所述第一莖環(huán)引物分子可直接固定在固相表面既作為滾環(huán)擴增引物又作為捕獲探針，此時第一莖環(huán)引物分子與靶核酸分子的雜交可直接打開第一莖環(huán)引物分子的莖部，暴露其3′ 端單鏈區(qū)，啟動莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應。

3.根據(jù)權利里要求1所述的莖環(huán)引物，其特征在于，所述第二莖環(huán)引物分子用熒光共振能量轉移熒光基團標記，制備為分子信標第二莖環(huán)引物分子，用于莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增的檢測。

4.一種基于權利要求1所述的莖環(huán)引物的莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增在非診斷核酸分子檢測中的應用。

5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，所述核酸分子檢測包括在液相中莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增檢測核酸分子和在固相表面上莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增檢測核酸分子。

6.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，所述液相中檢測核酸分子的過程為：將莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應組分包括莖環(huán)引物、滾環(huán)模板、具有鏈置換功能的DNA聚合酶、緩沖液、四種單核苷酸、待檢核酸樣品及水混合組成莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應體系，在所加DNA聚合酶的適宜反應溫度下孵育，完成莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增。

7.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述固相表面檢測核酸分子的過程為：首先將捕獲探針分子固定在固相介質表面；之后將待檢核酸樣品與固定在固相表面的捕獲分子雜交，使得待檢核酸分子被捕獲探針捕獲在固相表面；最后將莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應液包括莖環(huán)引物、滾環(huán)模板、具有鏈置換功能的DNA聚合酶、緩沖液及四種單核苷酸覆蓋帶有捕獲分子的固相表面，在所加DNA聚合酶的適宜反應溫度下孵育，完成莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增。

8.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述在液相中莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增的產物通過凝膠電泳、實時熒光定量監(jiān)測或目測進行報告。

9.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述在固相表面上莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增的產物通過熒光檢測、目測進行報告。

10.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，所述在液相中莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增的產物的凝膠電泳檢測指瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；所述實時熒光定量監(jiān)測是指在莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應添加核酸熒光染料，或可與莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增產物特異性雜交的分子信標，用熒光定量PCR儀等熒光檢測儀器實時動態(tài)觀察莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應進行檢測；所述目測是指在莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應完成后向反應液中加入可目測檢測的顯色物質，用肉眼直接觀察或借助放大鏡、顯微鏡觀察完成檢測。

11.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于，所述在固相表面上莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增的產物的熒光檢測是指在莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應添加熒光標記的單核苷酸，莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應后用熒光顯微鏡、基因芯片掃描儀及其他熒光成像儀器檢測；或指在莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應添加生物素標記的單核苷酸，莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應后將擴增產物與熒光標記的鏈霉親和素反應，最后用熒光顯微鏡、基因芯片掃描儀及其他熒光成像儀器觀測；所述目測是指在莖環(huán)引物-滾環(huán)擴增反應完成后向反應液中加入可肉眼檢測的顯色物質，用肉眼直接觀察或借助放大鏡、顯微鏡觀察完成檢測。