[發明專利]一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法

在審

• 申請號: 201711154978.3
• 申請日: 2017-11-20
• 公開（公告）號: CN108531545A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 朱華;謝鳳鳳;黎理;周雨晴;王躍峰;杜沛霖
• 申請（專利權）人: 廣西中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6895
• 代理公司: 南寧啟創知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 45122
• 代理人: 經國富

本發明公開一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，利用SAM法，對野生種拳卷地錢(Marchantia convoluta)進行SSR分子標記研究。利用改良的CTAB方法提取DNA，再經酶切、連接、抑制性PCR、預擴增、SAM法、PCR篩選拳卷地錢SSR引物。SAM法擴增結果條帶清晰，篩選得到陽性克隆進行測序，得到SSR引物序列。通過PCR篩選出有效擴增的拳卷地錢SSR引物。該SSR分子標記技術可作為拳卷地錢遺傳多樣性研究方法。

技術領域

本發明屬于遺傳分子技術領域,涉及中藥資源開發利用及遺傳多樣性研究,具體涉及一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法。

背景技術

目前，運用分子標記對生物體進行遺傳學研究已成為誕下的重點和熱點，如何在眾多的分子標記中選擇適當方法對遺傳研究的效率和成敗具有決定意義。而在眾多分子標記技術中，基于SSR標記特異性的擴增、良好的穩定性及重復性、能較好地反映物種的遺傳結構和遺傳多樣性變化等特點，被視為比較理想的遺傳標記方法。特別是近年在品種鑒定、地理來源鑒別研究、居群遺傳研究、有效成分與遺傳多樣研究等當中得到應用。然而SSR標記具有種屬特異性，不同物種間的SSR引物沒有通用性，必須針對每個物種開發特異引物進行PCR檢測。

拳卷地錢經廣西中醫藥大學生藥學專家鑒定為地錢科地錢屬植物拳卷地錢(Marchantia convoluta Gao et Chang)，采自廣西各地。據文獻報道，關于拳卷地錢生藥學鑒別研究、揮發性成分分析、黃酮類化合物研究、脂溶性成分研究、抗急性肝損傷及抗乙肝病毒藥理研究及ISSR-PCR擴增體系研究均見報道，但目前未見關于SSR遺傳標記研究內容。本文采用改良的CTAB法提取拳卷地錢DNA，經酶切、連接、抑制性PCR、預擴增、SAM法擴增得到預期片段，通過PCR篩選出有效擴增的拳卷地錢SSR引物，為拳卷地錢分子資源生藥鑒別、資源開發利用提供了技術基礎。

發明內容

本發明的目的是提供一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，以及由此方法得到拳卷地錢SSR 引物，通過對拳卷地錢SSR引物篩選的研究，得到了拳卷地錢SSR引物30對，是一種研究拳卷地錢遺傳多樣性較好研究方法。采用改良的CTAB法提取拳卷地錢DNA，經酶切、連接、抑制性PCR、預擴增、SAM法擴增得到預期片段，通過PCR篩選出有效擴增的拳卷地錢SSR引物，為拳卷地錢分子資源生藥鑒別、資源開發利用提供了技術基礎。

本發明的技術方案如下：

一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，該方法首先提取拳卷地錢的基因組DNA，然后進行酶切和連接、抑制性PCR、再進行預擴增和SAM法擴增、PCR篩選出拳卷地錢SSR引物。

作為技術方案的進一步改進，以上所述的一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，其特征在于：所述的提取拳卷地錢的基因組DNA為采用CTAB法從拳卷地錢葉片中提取到拳卷地錢的基因組DNA樣品。紫外分光光度計測定顯示用改良的CTAB法提取的拳卷地錢的基因組DNA的 OD 260/OD280比值，同時經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度。

作為技術方案的進一步改進，以上所述的一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，所述的酶切、連接為用限制性內切酶Mse I和Pst I對拳卷地錢的基因組DNA樣品進行雙酶切和連接，得到拳卷地錢DNA酶切和連接產物，拳卷地錢DNA酶切和連接產物的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其片段大小為100-1500bp。

作為技術方案的進一步改進，以上所述的一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，所述的預擴增為將拳卷地錢DNA酶切和連接產物進行預擴增，得到預擴增產物，所述的預擴增條件為： Takara Ex Taq 1U；10×Ex Taq Buffer 2μl；稀釋好的suppression PCR產物1μl；25mMMgC12 1.5μl；dNTP Mix(各2.5mM)1.5μl；Mse I adapter Primer 1 5pmol；Pst Iadapter primer 5pmol；ddH20至20μl；其中：