[發(fā)明專利]一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711154978.3
• 申請日: 2017-11-20
• 公開（公告）號: CN108531545A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱華;謝鳳鳳;黎理;周雨晴;王躍峰;杜沛霖
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6895
• 代理公司: 南寧啟創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 45122
• 代理人: 經(jīng)國富

1.一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，其特征在于：該方法首先提取拳卷地錢的基因組DNA，然后進行酶切和連接、再進行預(yù)擴增和SAM法擴增、PCR篩選出拳卷地錢SSR引物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，其特征在于：所述的提取拳卷地錢的基因組DNA為采用CTAB法從拳卷地錢葉片中提取到拳卷地錢的基因組DNA樣品。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，其特征在于：所述的酶切、連接為用限制性內(nèi)切酶Mse I和Pst I對拳卷地錢的基因組DNA樣品進行雙酶切和連接，得到拳卷地錢DNA酶切和連接產(chǎn)物，拳卷地錢DNA酶切和連接產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其片段大小為100-1500bp。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，其特征在于：所述的預(yù)擴增為將拳卷地錢DNA酶切和連接產(chǎn)物進行預(yù)擴增，得到預(yù)擴增產(chǎn)物，所述的預(yù)擴增條件為：Takara Ex Taq 1U；10×Ex Taq Buffer 2μl；稀釋好的suppression PCR產(chǎn)物1μl；25mMMgC12 1.5μl；dNTP Mix(各2.5mM)1.5μl；Mse I adapter Primer 1 5pmol；Pst Iadapter primer 5pmol；ddH20至20μl；其中：

Mse I adapter primer 1的序列：5'-GAC GAC CGA CGA GTA AC-'3

Pst I adapter primer 的序列：5'-AGA CTG CGT ACA TGC AGG A-'3。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，其特征在于：所述的SAM法擴增是將預(yù)擴增產(chǎn)物在反應(yīng)體系為：10×Ex Taq Buffer 2μl；稀釋好的預(yù)擴增產(chǎn)物2μl；Takara Ex Taq lU；25mM MgCl2 1.5μl；dNTP Mix(各2.5mM)1.5μl；Mse I adapter primer3(4～10)5pmol；SSR primer(PCT6)20pmol；加ddH20至20μl，的條件下進行SAM擴增，得到SAM擴增產(chǎn)物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，其特征在于：所述的SAM法擴增還包括SAM擴增產(chǎn)物的回收與克隆，所述的SAM擴增產(chǎn)物的回收與克隆為：通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳將SAM擴增產(chǎn)物分離，隨機挑選200個大小不同的SAM擴增片段，槍頭壓碎并用雙蒸水浸泡離心，進行第二次SAM擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳純化，DNA純化試劑盒回收，回收產(chǎn)物通過與PMD18-TVector的連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞，經(jīng)Amp+LB平板篩選得到陽性克隆，隨機從每個平板上挑選2個白色菌落，共克隆得到了100個SAM片段用于測序。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，其特征在于：所述的PCR篩選為：根據(jù)測序得到的DNA片段中所含的SSR的側(cè)翼序列采用Primerpremier5.0軟件設(shè)計特異引物，從86個片段中根據(jù)SSR位點的一側(cè)或兩側(cè)序列設(shè)計特異引物進行合成，然后與5′錨定兼并引物SSRprimer(PCT6)組成引物對，以拳卷地錢的基因組DNA為模板，經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出30對清晰條帶的特異引物，即為拳卷地錢SSR引物。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種篩選拳卷地錢SSR引物的方法，其特征在于：所述的PCR篩選為：所述的取到拳卷地錢的基因組DNA樣品后，還包括用紫外分光光度計測定顯示用拳卷地錢的基因組DNA的OD260/OD280比值，同時經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度。