[發(fā)明專利]將大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白轉(zhuǎn)化為利拉魯肽的制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711154044.X
• 申請日: 2017-11-20
• 公開（公告）號: CN107881187A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃亮;曹永恒;陳亮航;曹春來;周翠;夏志成
• 申請（專利權(quán)）人: 珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/605;C12N15/62
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司44245
• 代理人: 裘暉,蘇運(yùn)貞

1.一種將大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白轉(zhuǎn)化為利拉魯肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)將具有融合基因的大腸桿菌工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，誘導(dǎo)，提取含有融合蛋白的包涵體或者融合蛋白；其中，融合基因具有形如A-B-C結(jié)構(gòu)的基因序列，其中A為伴侶蛋白編碼基因，B為連接肽編碼基因，C為Arg34-GLP-1(7-37)片段編碼基因；

(2)將步驟(1)中獲得的融合蛋白或者含有融合蛋白的包涵體在變性溶液充分溶解變性，并加入一定量的有機(jī)溶劑、縛酸劑及脂肪酸活化物，得到反應(yīng)體系，反應(yīng)，使融合蛋白與脂肪酸活化物酰化連接；

(3)待步驟(2)反應(yīng)完成后加入工具酶，得到酶切體系；酶切，得到利拉魯肽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白轉(zhuǎn)化為利拉魯肽的制備方法，其特征在于：

所述的伴侶蛋白為KSI、PagP或TrxA蛋白；

所述的連接肽為如X₁…X_nK所示的肽序列，X為D或者E，n表示氨基酸X的數(shù)目，為2至4的整數(shù)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的將大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白轉(zhuǎn)化為利拉魯肽的制備方法，其特征在于：所述的連接肽為EEEEK、EDK或DDDDK。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白轉(zhuǎn)化為利拉魯肽的制備方法，其特征在于：

所述的有機(jī)溶劑的用量按其在反應(yīng)體系中的濃度為體積百分比為5～50％計(jì)算；

所述的縛酸劑的加入量按能夠使反應(yīng)體系的pH值達(dá)到8.0～12.0計(jì)算；

步驟(2)中所述的脂肪酸活化物的用量按融合蛋白：脂肪酸活化物的摩爾比例為1：1～10計(jì)算。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白轉(zhuǎn)化為利拉魯肽的制備方法，其特征在于：

步驟(2)中所述的變性溶液為尿素、鹽酸胍和SDS中的至少一種；

步驟(2)中所述的有機(jī)溶劑為N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈和二甲基亞砜中的一種或至少兩種；

步驟(2)中所述的縛酸劑為三乙胺，N,N-二異丙基乙胺和吡啶中的一種或至少兩種；

步驟(2)中所述的脂肪酸活化物選自N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OBu^t或N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OH；

步驟(3)中所述的工具酶為具有切割連接肽中賴氨酸殘基功能的酶。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的將大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白轉(zhuǎn)化為利拉魯肽的制備方法，其特征在于：所述的工具酶為賴氨酰內(nèi)切酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的將大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白轉(zhuǎn)化為利拉魯肽的制備方法，其特征在于：所述的賴氨酰特異性內(nèi)切酶的加入按包涵體中融合蛋白總量計(jì)算，1g融合蛋白加入2.5～20IU賴氨酰特異性內(nèi)切酶。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白轉(zhuǎn)化為利拉魯肽的制備方法，其特征在于：

步驟(2)中所述的反應(yīng)的條件為攪拌狀態(tài)下反應(yīng)3小時(shí)；

步驟(3)中所述的酶切的條件為pH8.0～10.5酶切8h。

9.權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)所述的將大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白轉(zhuǎn)化為利拉魯肽的制備方法在工業(yè)化制備利拉魯肽中的應(yīng)用。