[發明專利]將大腸桿菌表達的融合蛋白轉化為利拉魯肽的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201711154044.X
• 申請日: 2017-11-20
• 公開（公告）號: CN107881187A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 黃亮;曹永恒;陳亮航;曹春來;周翠;夏志成
• 申請（專利權）人: 珠海聯邦制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/605;C12N15/62
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 裘暉,蘇運貞

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，特別涉及一種將大腸桿菌表達的融合蛋白轉化為利拉魯肽的制備方法及應用。

背景技術

據IDF統計，2015年全球糖尿病的患病率達到4.15億人，每11個人中就有1人患糖尿病，其中90％以上的糖尿病患者為2型糖尿病。胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide，GLP-1)及其類似物是近年來治療2型糖尿病的一類新型藥物，能夠促進葡萄糖濃度依賴性的胰島素分泌，實現胰島β細胞的保護和α細胞的調節作用，從而達到穩定的降糖效果，不易誘發低血糖。

由于GLP-1及其類似物在治療2型糖尿病的優良效果，使其近年來在糖尿病治療藥物市場中逐漸占據重要地位。人體內具有生物活性的GLP-1主要是GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)，天然的GLP-1容易被二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)迅速水解失活，不具有臨床使用價值。因此對GLP-1結構修飾，形成具有同樣藥理活性的GLP-1類似物，并掩蓋DPP-Ⅳ的結合位點，延長半衰期是該類藥物研發的主要課題。如今已有多個GLP-1類似物上市，如：利拉魯肽、艾塞那肽、阿必魯肽、杜拉魯肽等，該類藥物在未來10年里將會是抗糖尿病藥物的重要增長點。

利拉魯肽屬于長效GLP-1類似物，是一類具有顯著降低血糖水平及修復胰島細胞功能的腸促降糖激素，能模仿人GLP-1葡萄糖濃度依賴性的降糖活性，抑制患者胃腸運動和排空，避免口服類降糖藥和胰島素類降糖藥的不足，如體重增加、長期血糖濃度及HbA1c水平控制不佳、嚴重低血糖等不良反應，顯著提高患者的生活質量，是治療2型糖尿病的理想藥物。

利拉魯肽由丹麥諾和諾德公司研制，其序列為：

H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。

由上述利拉魯肽結構可以看出，利拉魯肽分子是在Arg³⁴-GLP-1(7-37)蛋白片段的基礎上，在Lys²⁶側鏈上連接一個十六碳棕櫚脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))而得。目前對于利拉魯肽的生產制備工藝上，可以分為化學與生物兩大途徑。

化學方面，主要是采用化學合成多肽的方法。中國專利CN102875665、CN103275208、CN103304660等公開了利拉魯肽的化學制備方法，但這些化學合成方法需要用到大量的有機溶劑，對環境造成嚴重污染，并且化學合成副反應較多，產率低，所使用的氨基酸原料成本高，整體生產成本較高。

與化學合成法相比，生物法在環境友好性、工藝簡單以及成本低廉等方面的優勢而受到人們的重視。目前主要是采用基因重組工程菌發酵得到含Arg³⁴-GLP-1(7-37)蛋白片段之后，再對其進行酰化修飾，即在Lys²⁶側鏈上連接上十六碳棕櫚脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))。這種制備思路的難點在于Arg³⁴-GLP-1(7-37)蛋白的制備及修飾。

目前來說，大腸桿菌比較多地被用于GLP-1衍生物的發酵生產。這是因為利用大腸桿菌作為宿主表達Arg³⁴-GLP-1片段，相較酵母具有更容易融合表達，產量高，無糖基化及酶干擾的優勢。因而，大腸桿菌也逐漸成為GLP-1衍生物的主要生物生產途徑。目前在大腸桿菌生產利拉魯肽方面，普遍是將Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段融合分子伴侶和連接肽進行表達，然后將分子伴侶及連接肽用特異性工具酶切除，得到Arg³⁴-GLP-1(7-37)后再對其進行修飾得到利拉魯肽。例如中國專利CN104745597A公開了一種高效表達重組利拉魯肽蛋白的方法，該方法是將Arg³⁴-GLP-1(7-37)通過腸激酶酶切位點連接HIS標簽形成基因片段HIS-EK-(Arg³⁴-GLP-1(7-37))，然后將基因片段載入大腸桿菌中進行該融合蛋白的表達。利用HIS標簽親和吸附得到融合蛋白后，再利用腸激酶特異性酶切腸激酶位點得到Arg³⁴-GLP-1