[發(fā)明專利]一種基于熒光共振能量轉移的二氧化硅熒光免疫標記探針、制備方法及應用

在審

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• 申請日: 2017-11-18
• 公開（公告）號: CN107976538A
• 公開（公告）日: 2018-05-01
• 發(fā)明（設計）人: 張明翠;閆希
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產(chǎn)權代理有限公司34107
• 代理人: 任晨晨

技術領域

本發(fā)明屬于生物分析和免疫分析領域，具體涉及一種基于熒光共振能量轉移的二氧化硅熒光免疫標記探針、制備方法及應用。

背景技術

聚琥珀酰亞胺(PSI)，N-(3-氨基丙基)咪唑(NAPI)和油胺(OAm)共同反應，得到的PSI-OAm-NAPI兩親聚合納米顆粒(MFAP)是一種聚合物納米藥物載體。聚合物乳劑遞送系統(tǒng)已廣泛用于包封藥物，許多聚合物納米藥物遞送系統(tǒng)在臨床應用中得到批準，或正在用于治療癌癥的臨床試驗研究中。進入生物體后的代謝情況與生物體的健康密不可分，過量的藥物劑量可能會引起載體代謝緩慢從而對生物體產(chǎn)生毒副作用。因此，藥物載體的定量測定對于考察該材料是否適于臨床應用尤為重要。

熒光免疫技術不僅充分利用了免疫分析的特異性還與熒光的敏感性相結合，在疾病防治、臨床檢測、藥物篩選、食品安全等方面都有著十分廣泛的應用。其中抗體的特異性和活性對免疫分析的準確性起決定作用；標記物的熒光強度和穩(wěn)定性則是靈敏度高，重現(xiàn)性好的關鍵因素。因此，熒光標記技術及標記物的篩選對高靈敏的熒光免疫分析方法建立起到舉足輕重的作用。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于熒光共振能量轉移的二氧化硅熒光免疫標記探針及其制備方法，為建立特異性好、重現(xiàn)性好、高靈敏的免疫分析程序提供了新的標記探針；該法以介孔二氧化硅納米顆粒為基體，摻雜熒光染料羅丹明B和BODIPY構建熒光共振能量轉移體系(RB-BODIPY-FRET)。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于熒光共振能量轉移的二氧化硅熒光免疫標記探針的應用，采用新的標記方法偶聯(lián)抗體進一步提高了偶聯(lián)效率并保證了抗體活性，消除交聯(lián)劑對抗體活性的影響；為納米藥物載體的超靈敏檢測免疫分析提供了可靠依據(jù)。

本發(fā)明提供的一種基于熒光共振能量轉移的二氧化硅熒光免疫標記探針的制備方法，包括以下步驟：

1)、將十六烷基三甲基溴化銨CTAB溶于去離子水；

2)、加入乙二醇和氨水；

3)、之后加入正硅酸乙酯TEOS反應；

4)、然后，再加入混合好的BODIPY溶液和羅丹明B溶液，再加入三甲氧基甲基硅烷MTMS，反應；

5)、再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES繼續(xù)反應；離心洗滌，冷凍干燥，得RB-BODIPY-FRET二氧化硅納米粒子，即為基于熒光共振能量轉移的二氧化硅熒光免疫標記探針。

上述制備過程中全程回流冷凝。從步驟1)開始，全程均在60-70℃條件下反應。

步驟1)中十六烷基三甲基溴化銨CTAB在60-70℃攪拌條件下溶于去離子水中。

步驟3)中加入乙二醇和氨水后3-6min內加入正硅酸乙酯TEOS；反應時間為30-60min。

步驟4)所述反應時間為2-4h。

所述BODIPY溶液制備方法為稱取摩爾質量為0.001-0.006mmol的BODIPY溶于1mLDMF，所述羅丹明B溶液制備方法為0.001-0.006mmol的羅丹明B溶于1mL去離子水；混合好的BODIPY溶液和羅丹明B溶液事先混合好保證反應過程中介孔二氧化硅吸附兩種染料到介孔中的能力相同，避免一種染料先加入占據(jù)大多數(shù)介孔。

進一步的，步驟4)中BODIPY和羅丹明B摩爾比為1:1，并控制混合前BODIPY溶液和羅丹明B溶液濃度相同，分別為0.001mmol/mL，0.002mmol/mL，0.003mmol/mL，0.004mmol/mL，0.005mmol/mL，0.006mmol/mL；一系列加入量考察擇優(yōu)選擇。優(yōu)選的，為0.004mmol/mL，0.005mmol/mL的濃度，所制備的熒光納米標記探針熒光強度高，穩(wěn)定性好。

步驟4)混合前BODIPY溶液濃度為0.001mmol/mL-0.006mmol/mL；混合前羅丹明B溶液濃度為0.001mmol/mL-0.006mmol/mL。

所述BODIPY制備方法為：

A、20-25℃下在含有40-60mL水的圓底燒瓶中邊攪拌邊加入1-3mL吡咯，1-3mL均三苯甲醛，充分攪拌均勻；

B、加入0.2-1mL濃HCl，并于20-25℃反應12-24h，有大量黑色沉淀生成，抽濾后用石油醚洗滌，得到粗產(chǎn)品粉末1；

C、取200-600mg粗產(chǎn)品粉末1溶于40-60mL無水四氫呋喃中，在磁力攪拌下加入N-氯代丁二酰亞胺NCS 300-700mg，20-25℃反應1-3h。