[發明專利]簡并引物及利用該引物克隆植物中抗病蟲害蛋白基因的方法

在審

• 申請號: 201711148288.7
• 申請日: 2017-11-17
• 公開（公告）號: CN107937393A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 鮑錦庫;吳傳芳;梁丹鳳;龍鑫;袁媛
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/29;C12N15/10
• 代理公司: 成都中亞專利代理有限公司51126
• 代理人: 李文榮

技術領域

本發明屬于抗農業病蟲害植物分子領域，特別涉及利用通用簡并引物大規模克隆植物中抗農業病蟲害蛋白基因。

背景技術

通過對蘭科、百合科、天南星科和石蒜科植物海芋、風雨花、朱頂蘭、玉蓮、黃花石蒜、大蒜、蔥、脈羊耳蘭、黃精等的研究表明，在其植物體內，含有豐富的能特異結合甘露糖的蛋白質，并且，這些能特異結合甘露糖的蛋白質對農作物害蟲及病害具有顯著的抑制效果。這為轉基因作物抗農業病蟲害的研究和生產提供了新的候選基因資源。面對一個具有抗農業病蟲害活性的巨大的候選基因資源群體，通常，多是通過設計特異性的引物，克隆其中的一個基因，經基因工程的方式應用到轉基因農作物中。而找到植物中甘露糖結合蛋白家族基因的簡并引物，能有效地大規模克隆此類目的基因，并且對研究未被報道的該蛋白家族基因提供有力的引導。目前，還未出現與之相關的簡并引物設計及序列的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一對植物中具有抗農業病蟲害的甘露糖結合蛋白質的基因家族的簡并引物，用以大規模克隆該類基因家族成員，為抗農業病蟲害轉基因農業研究和生產提供豐富的候選基因資源。

本發明所述的簡并引物設計，是利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫，以“mannose-binding lectin”為檢索詞，進行“Nucleotide”檢索，得到植物中甘露糖結合蛋白質的基因的所有記錄條目，進入“Zephyranthes candida lectin mRNA,complete cds”條目，接著進入其指向的蛋白記錄頁面

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/20531731)。

在上述的蛋白記錄頁面，進行“RunBlast”，將所有100條已記錄的氨基酸序列進行多序列比對，從而發現這些植物中甘露糖結合蛋白序列中的保守氨基酸序列，比對結果見

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi。

選擇這些蛋白質中的一條氨基酸序列，至引物設計軟件Primer Premier5中，先將其翻譯為核苷酸序列，由于密碼子的簡并性，得到一條具有簡并性的核苷酸鏈，據此，將比對結果中的植物甘露糖結合蛋白的保守區域包含在這條簡并性核苷酸序列之內，設計合適的簡并引物對。

這對簡并引物的序列是：

上游引物：5’-AYGGNCCNTAYACNTTYATHATGC-3’；

下游引物：5’-RTNAGTNCCNGTNGCCCAYT-3’。

簡并引物中：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝G/C，W＝A/T，H＝A/T/C，B＝G/T/C，V＝G/A/C，N＝A/T/G/C。

我們還提供了一種大規模克隆植物中抗農業病蟲害蛋白基因的方法，該方法包括以下步驟：利用上述一對簡并引物對單子葉植物甘露糖結合蛋白基因的保守序列進行PCR反應，然后以此PCR產物為反應模板，利用3’，5’RACE的方法，對該單子葉植物甘露糖結合蛋白基因序列進行PCR反應，最終克隆到目的基因。

所述單子葉植物包括但不局限于蘭科(Orchidaceae)、百合科(Liliaceae)、天南星科(Araceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)植物。

進一步的，所述農業病蟲害包括：刺吸式口器害蟲中的棉蚜、麥蚜、桃蚜蚜蟲、褐飛虱、葉蟬及鱗翅目害蟲；以及水稻稻瘟病、紋枯病、小麥赤霉病。

本發明提供了植物中具有抗農業病蟲害生物活性的甘露糖結合蛋白的基因的簡并引物，可用于大規模克隆該家族中基因，為其更廣泛應用于抗農業病蟲害轉基因農業的研究實踐提供基礎，并且對還未被發現的該家族蛋白成員的研究提供支持。

具體實施方式

實施例一：玉簾(Zephyranthes candida(Lindl.))和一葉蘭(Aspidistra elatior Blume)植物中甘露糖結合蛋白的基因克隆

實施例1：玉簾、一葉蘭中總RNA提取、質量檢測及反轉錄

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料：玉簾和一葉蘭植物分別采集自中國四川峨眉山及屏山，冷凍保存于-80℃備用。