[發明專利]單分子水平觀測氣孔保衛細胞膜蛋白分布和動態的方法

有效

• 申請號: 201711146160.7
• 申請日: 2017-11-17
• 公開（公告）號: CN108195801B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 李曉娟;崔亞寧;林金星
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京勁創知識產權代理事務所(普通合伙) 11589
• 代理人: 徐家升

單分子水平實時觀測植物氣孔保衛細胞膜蛋白分布和動態的方法，涉及生物技術領域。該方法包括以下步驟：A、獲得熒光標記目的基因的轉基因材料；B、以全內反射熒光顯微鏡獲取保衛細胞膜蛋白的實時影像；C、通過Image J軟件將所得時間序列圖像進行處理；D、通過Matlab R2014a對目的蛋白進行單顆粒追蹤分析，確定單個蛋白聚合體的動態；E、計算氣孔保衛細胞膜蛋白在細胞質膜上的停留時間；F、對目的蛋白的停留時間參數進行高斯擬合，確定目的蛋白的停留時間及變化。此方法具有提高成像的信噪比，可進行高分辨率的觀測，成像速度快，活體可視化及可重復性高的優點。本發明在植物基因功能研究中具有實際應用價值。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種單分子水平實時觀測植物氣孔保衛細胞膜蛋白分布和動態的方法。

背景技術

氣孔是植物與外界環境進行氣體和水分交換的門戶，控制著光合作用吸收CO₂、水分蒸發，在植物的生命活動中具有重要作用。形成氣孔的保衛細胞通過感知環境刺激，調控氣孔的關閉與開合。特別是在氣孔保衛細胞膜上定位的蛋白，在感受外界環境以及調控氣孔應答生物和非生物脅迫中具有重要功能。然而，以往對保衛細胞中蛋白的研究，主要是利用光學顯微鏡在突變體等遺傳材料中對植物氣孔開度進行測量。這種方法僅是把氣孔作為一個整體進行研究，不能對保衛細胞膜蛋白進行直接分析。特別是，不能對感受刺激后保衛細胞膜蛋白的動態特征進行實時檢測分析。

已有研究報道，細胞膜是一個非均相的高度動態的生物學體系，因此質膜蛋白的時空動態必然與很多基礎細胞學過程密切相關。但是，植物的保衛細胞存在細胞壁厚、自發熒光強，容易對最終數據產生干擾，以及長時間照射造成的細胞光損害和光漂白等都可能會對分子動力學的測量產生影響。特別是保衛細胞與葉表皮細胞不在同一平面，導致成像困難。

現有技術中缺少一種實時觀測植物氣孔保衛細胞膜蛋白分布的方法，尤其缺少一種高分辨率并且能夠快速對氣孔保衛細胞膜蛋白分布進行動態觀測的方法。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種實時觀測植物氣孔保衛細胞膜蛋白分布和動態的方法，尤其是提供一種高分辨率實時觀測氣孔保衛細胞膜上蛋白分布、運動和停留時間的方法。

具體包括以下步驟：

(1)獲得帶有熒光標簽的轉基因植株；

(2)用全內反射熒光顯微鏡，選擇標記熒光蛋白所對應波長的激發光對由步驟(1)所得轉基因植株進行觀察，調整激光入射角度，在細胞壁與細胞膜之間發生全內反射，并獲得時間序列圖像；

(3)應用Image J 1.48軟件對步驟(2)獲取的時間序列圖像進行處理，獲得影像信息，進行目的蛋白分布分析；

(4)應用Matlab 2014a(The Mathworks)對步驟(2)獲取的時間序列圖像中的熒光信號進行單顆粒追蹤，分析蛋白運動軌跡；

(5)根據步驟(2)獲取的時間序列圖像，應用Image J 1.48分析熒光點的熒光強度，記錄從熒光信號出現到完全消失所持續的幀數，與曝光時間和拍攝時間間隔進行相應的換算，計算出熒光分子在焦平面上的存在時長(lifetime)，從而獲得目的蛋白在細胞質膜上的停留時間(dwell time)的，以及從細胞質膜上解離的程度；

(6)對氣孔保衛細胞膜蛋白停留時間進行高斯擬合。

進一步，所述步驟(1)中，首先通過聚合酶連鎖反應(Polymerase chainreaction，PCR)擴增待測蛋白的基因，通過雙酶切、連接的手段將目的蛋白的基因插入到表達載體pCM2300中，與編碼熒光標記蛋白的基因融合，最后通過農桿菌侵染得到轉基因植株，從而在所述轉基因植株中實現對目的蛋白的熒光標記。所述目的基因為植物氣孔保衛細胞膜上表達的基因，所用載體為植物雙元表達載體。