[發明專利]單分子水平觀測氣孔保衛細胞膜蛋白分布和動態的方法

有效

• 申請號: 201711146160.7
• 申請日: 2017-11-17
• 公開（公告）號: CN108195801B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 李曉娟;崔亞寧;林金星
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京勁創知識產權代理事務所(普通合伙) 11589
• 代理人: 徐家升

1.一種單分子水平實時觀測植物氣孔保衛細胞膜蛋白分布和動態的方法，包括以下步驟：

A步驟、將目的蛋白的基因插入到表達載體中，與編碼熒光標記蛋白的基因融合，通過農桿菌侵染得到轉基因植株，在所述轉基因植株中實現對目的蛋白的熒光標記；以轉基因植株擬南芥種子置于濾紙上，將85％乙醇和H ₂O ₂配比為3：1的消毒液灑到擬南芥種子上，待種子表面的消毒液干后，將所述種子播種于含1/2Murashige-skoog固體培養基上；將培養皿放于4℃冰箱進行春化，春化24h后拿出，置于智能光照培養箱中進行培養，培養溫度為22℃，光照條件為16小時光照和8小時暗培養循環；在載波片上滴加培養基溶液，將擬南芥幼苗置于載玻片上，然后加蓋普通蓋玻片；蓋玻片與載玻片之間充滿溶液但無氣泡；

B步驟、使用100X、數值孔徑為1.45的鏡頭，滴加鏡油，調節488nm激光入射角度數值為1.325，調節激光強度到物鏡出口激光強度為1mW；在此物理條件下，曝光時間為100ms，電子增益為300，用20Hz頻率對樣品進行時間序列成像，每兩幀圖像之間時間間隔為0，獲得連續的時間序列圖像200幀；激發光的激發波長為488nm，收集波長為525nm；設定曝光時間100ms，EM Gain為300倍，頻率20Hz對樣品進行連續成像；

C步驟、對所獲得的時間序列圖像進行Subtract Background處理；

D步驟、對所獲得的時間序列圖像進行單顆粒追蹤，應用軟件Matlab R2014a，獲得每個時間點的圖像中每個熒光點的坐標信息以及熒光強度信息，綜合時間和熒光點坐標信息，計算目的蛋白的運動軌跡；通過連續追蹤熒光信號，保衛細胞膜蛋白在膜上呈現高度動態，不斷地出現和消失，取停留大于2幀的熒光點用于進行膜上停留時間分析；

E步驟、綜合時間和熒光強度信息，對目的蛋白的停留時間動態進行分析；從熒光分子在焦平面上出現到完全消失，所持續的幀數，與曝光時間和拍攝時間間隔進行相應的換算，計算出熒光分子的停留時間；

F步驟、對氣孔保衛細胞膜蛋白停留時間進行高斯擬合。

2.根據權利要求1所述的一種單分子水平實時觀測植物氣孔保衛細胞膜蛋白分布和動態的方法，其特征在于：所述A步驟中首先通過聚合酶連鎖反應擴增目的基因，通過雙酶切、連接的手段將目的基因插入到表達載體pCAMBIA 2300中，最后通過農桿菌侵染得到具有熒光標簽的轉基因材料。

3.根據權利要求1所述的一種單分子水平實時觀測植物氣孔保衛細胞膜蛋白分布和動態的方法，其特征在于：所述A步驟中目的蛋白為植物保衛細胞膜上表達的功能蛋白，所用載體為植物雙元表達載體，種植轉基因植株的培養皿需要直立放置，使植物根完全垂直地面生長，便于全內反射熒光顯微鏡觀察。

4.根據權利要求1所述的一種單分子水平實時觀測植物氣孔保衛細胞膜蛋白分布和動態的方法，其特征在于：所述A步驟中在載波片上滴加50μL1/2Murashige-skoog培養基溶液，將生長3-5天的轉基因材料幼苗置于載玻片上，將葉片遠軸面貼近載玻片；所述載玻片的折射率為1.52。

5.根據權利要求1或4所述的一種單分子水平實時觀測植物氣孔保衛細胞膜蛋白分布和動態的方法，其特征在于：所述C步驟中，對由所述B步驟所得到的圖像運用小波變換算法處理進行背景去除，通過計算熒光點周圍3×3個像素的局部極大值得到亞像素精確值，計算出熒光點的權重重心而確定熒光點的位置；借助Image J 1.48進行蛋白分布的分析；在ImageJ軟件中打開綠色通道圖像，選擇“process-Subtract Background-”設置“RollingBall Radius”設置為“25Pixels”；運行“Image-Adjust-Brightness/Contrast”，調整圖像的亮度和對比度，設置“JPEG Quality”為“100”，然后將圖像均另存為TIFF格式。