[發(fā)明專利]一種牛血清中牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711145762.0
• 申請日: 2017-11-17
• 公開（公告）號: CN107881260A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱禮倩;朱國強;黃麗媛
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司32252
• 代理人: 戴朝榮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動物病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛血清中牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定的方法。

背景技術(shù)

BVDV(牛病毒性腹瀉病毒)屬于黃病毒科瘟病毒屬。該病毒是單股正鏈RNA病毒，基因組全長約12.3Kb，包括一個開放閱讀框(openreading frame,ORF)、5’非翻譯區(qū)(5'untranslated region,5’-UTR)和3’非編碼區(qū)(3'untranslated region,3’-NCR)。基于BVDV5’-UTR序列的高度保守性，可以將BVDV分成BVDV-1和BVDV-2兩個基因型，它們之間的抗原性和遺傳性差異較大。除了5’-UTR以外，也可以根據(jù)Npro和E2的基因序列進行基因分型，其結(jié)果與按照5’-UTR序列分類基本一致。

BVDV病毒除了感染牛以外，還可以感染豬、羊等40多種動物，并能致發(fā)病，急性感染后可以轉(zhuǎn)為持續(xù)性感染(Persistent infection,PI)，PI患畜終生帶毒、排毒，促進了本病毒的傳播。目前已確定有8種動物可以發(fā)生BVDV持續(xù)性感染。1997年Terpstra and Wensvoort首次報道了豬發(fā)生BVDV持續(xù)性感染的病例。PI牛是豬BVDV感染的重要傳染源，若PI牛的血清制備細胞疫苗，使用于豬、牛和羊等BVDV易感動物是造成BVDV傳播的重要途徑。

采用商品化的ELISA抗原檢測試劑盒可以篩查BVDV PI牛，然而該試劑盒依賴于進口產(chǎn)品，價格昂貴。在生產(chǎn)和科研中用于細胞培養(yǎng)的牛血清需經(jīng)過病毒滅活處理，如果病毒滅活不徹底會導(dǎo)致病毒的散播。商品化的BVDV ELISA檢測試劑盒無法區(qū)分滅活的病毒和有感染性的病毒。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種對牛血清中牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定的方法，可用于檢測具有感染性的病毒，為牛病毒性腹瀉的診斷及研究提供依據(jù)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種對牛血清中牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定的方法，具體過程如下：

步驟1)第一輪盲傳：將MDBK細胞與牛血清樣品進行作用后，去除一半血清加入無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后將細胞培養(yǎng)物進行凍融；

步驟2)第二輪盲傳：將MDBK細胞與步驟1)所得細胞培養(yǎng)物進行作用后，加入含2％馬血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后將細胞培養(yǎng)物進行凍融；

步驟3)第三輪盲傳：將MDBK細胞與步驟2)所得細胞培養(yǎng)物進行作用，棄掉上清后加入含2％馬血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后將細胞培養(yǎng)物進行凍融；

步驟4)離心處理：步驟3)所得細胞培養(yǎng)物經(jīng)兩次離心后保留上清液；

步驟5)RNA提取：步驟4)的上清液加入TRIzol LS Reagent并吹打作用后，加入氯仿混勻作用，再經(jīng)離心得上層清液；上層清液與異丙醇作用后離心棄異丙醇液，加入酒精繼續(xù)離心棄酒精液得RNA；

步驟6)合成病毒基因組cDNA：利用試劑盒將步驟5)RNA反轉(zhuǎn)錄合成病毒基因組cDNA；

步驟7)PCR反應(yīng)：將步驟6)所得cDNA進行PCR反應(yīng)完成血清樣品中牛病毒性腹瀉病毒的分離鑒定。

進一步地，所述牛血清樣品來自牛尾靜脈處采集的血樣或細胞疫苗用牛血清樣等。優(yōu)選地，所述牛尾靜脈處采集的血樣凝固后吸取血清，將血清進行離心后得到牛血清樣品。優(yōu)選地，所述細胞疫苗用牛血清樣一般是指商品化的牛血清。

進一步地，所述步驟1)中的MDBK細胞經(jīng)過過夜培養(yǎng)，且長滿80％左右。

進一步地，所述步驟1)中MDBK細胞與牛血清樣品在5％CO₂細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，作用4小時。

進一步地，所述步驟1)中無血清的培養(yǎng)基為無血清的DMEM培養(yǎng)基，加入量為去除的一半血清的量。

進一步地，所述步驟1)中繼續(xù)培養(yǎng)的時間為48～56小時。

進一步地，所述步驟1)中凍融過程如下：步驟1)的細胞培養(yǎng)物于-20℃凍存過夜后室溫放置，解凍后反復(fù)吹打。

進一步地，所述步驟2)中的MDBK細胞經(jīng)過過夜培養(yǎng)，且長滿80％左右。

進一步地，所述步驟2)中MDBK細胞與步驟1)所得細胞培養(yǎng)物在5％CO₂細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，作用2小時。

進一步地，所述步驟2)中繼續(xù)培養(yǎng)在5％CO₂細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，時間為48～56小時。

進一步地，所述步驟2)中凍融過程如下：步驟2)的細胞培養(yǎng)物于-20℃凍存過夜后室溫放置，解凍后反復(fù)吹打。