[發明專利]一種牛血清中牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定的方法

在審

• 申請號: 201711145762.0
• 申請日: 2017-11-17
• 公開（公告）號: CN107881260A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 朱禮倩;朱國強;黃麗媛
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司32252
• 代理人: 戴朝榮

1.一種對牛血清中牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定的方法，其特征在于，具體過程如下：

步驟1)第一輪盲傳：將MDBK細胞與牛血清樣品進行作用后，去除一半血清加入無血清的培養基繼續培養，培養完成后將細胞培養物進行凍融；

步驟2)第二輪盲傳：將MDBK細胞與步驟1)所得細胞培養物進行作用后，加入含2％馬血清的培養基繼續培養，培養完成后將細胞培養物進行凍融；

步驟3)第三輪盲傳：將MDBK細胞與步驟2)所得細胞培養物進行作用，棄掉上清后加入含2％馬血清的DMEM培養基繼續培養，培養完成后將細胞培養物進行凍融；

步驟4)離心處理：步驟3)所得細胞培養物經兩次離心后保留上清液；

步驟5)RNA提取：步驟4)的上清液加入TRIzol LS Reagent并吹打作用后，加入氯仿混勻作用，再經離心得上層清液；上層清液與異丙醇作用后離心棄異丙醇液，加入酒精繼續離心棄酒精液得RNA；

步驟6)合成病毒基因組cDNA：利用試劑盒將步驟5)RNA反轉錄合成病毒基因組cDNA；

步驟7)PCR反應：將步驟6)所得cDNA進行PCR反應完成血清樣品中牛病毒性腹瀉病毒的分離鑒定。

2.根據權利要求1所述的牛血清中牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定的方法，其特征在于，所述牛血清樣品來自牛尾靜脈處采集的血樣或細胞疫苗用牛血清樣。

3.根據權利要求1所述的對牛血清中牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定的方法，其特征在于，所述步驟1)中的MDBK細胞經過過夜培養，且長滿80％；所述步驟1)中MDBK細胞與牛血清樣品在5％CO₂細胞培養箱內，作用4小時；

所述步驟1)中無血清的培養基為無血清的DMEM培養基，加入量為去除的一半血清的量；

所述步驟1)中繼續培養的時間為48～56小時；

所述步驟1)中凍融過程如下：步驟1)的細胞培養物于-20℃凍存過夜后室溫放置，解凍后反復吹打。

4.根據權利要求1所述的對牛血清中牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定的方法，其特征在于，所述步驟2)中的MDBK細胞經過過夜培養，且長滿80％；所述步驟2)中MDBK細胞與步驟1)所得細胞培養物在5％CO₂細胞培養箱內，作用2小時；

所述步驟2)中繼續培養在5％CO₂細胞培養箱內，時間為48～56小時；

所述步驟2)中凍融過程如下：經步驟2)的細胞培養物于-20℃凍存過夜后室溫放置，解凍后反復吹打。

5.根據權利要求1所述的牛血清中牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定的方法，其特征在于，所述步驟3)中MDBK細胞過夜培養長滿至80％后，去除培養基，再加入步驟2)所得細胞培養物、無血清DMEM培養基在5％CO₂細胞培養箱內，作用2小時；

所述步驟3)中繼續培養在5％CO₂細胞培養箱內，時間為48～56小時；

所述步驟3)中凍融過程如下：步驟3)的細胞培養物于-20℃凍存過夜后室溫放置，解凍后反復吹打。

6.根據權利要求1所述的對牛血清中牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定的方法，其特征在于，所述步驟4)中兩次離心是指：先經離心機5000rpm/min，4℃離心5min，去除細胞碎片；然后再經過離心機12000rpm/min，4℃離心10min。

7.根據權利要求1所述的牛血清中牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定的方法，其特征在于，所述步驟5)中加入TRIzol LS Reagent并吹打作用是指加入TRIzol LS Reagent并吹打室溫作用5min；

所述步驟5)中加入氯仿混勻作用是指加入氯仿混勻后室溫作用10min；

所述步驟5)中離心得上層清液是指用離心機13000rpm/min，4℃離心15min得上層清液；

所述步驟5)中上層清液與異丙醇作用后離心棄異丙醇液，加入酒精繼續離心棄酒精液得RNA的具體過程如下：上層清液與異丙醇室溫作用10min后離心機13000rpm/min，4℃離心15min棄異丙醇液，加入75％酒精繼續離心機8000rpm/min，4℃離心5min棄酒精液，加入去離子水溶解得RNA。