[發明專利]一種抗VEGF基因、及利用其修飾的T細胞、制備方法和應用

有效

• 申請號: 201711145502.3
• 申請日: 2017-11-17
• 公開（公告）號: CN108034669B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 劉明錄;強邦明;王立新;張傳鵬;金海鋒;韓慶梅;劉敏;王亮
• 申請（專利權）人: 山東興瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N5/10;C12N15/867;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 山東華君知識產權代理有限公司 37300
• 代理人: 呂翠蓮

1.一種抗VEGF基因，其特征在于：該基因由導引子、VEGF抗原結合區、CD3抗原結合區、CD8的Hinge區、CD8的跨膜區與共刺激分子依序串聯組成；

所述共刺激分子包括4-1BB胞內區和 CD3ζ胞內區的共刺激分子；

導引子的核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示；

VEGF抗原結合區的核苷酸序列為SEQ ID NO.3所示；

CD3抗原結合區的核苷酸序列為SEQ ID NO.4所示；

CD8Hinge區的核苷酸序列為SEQ ID NO.5所示；

CD8跨膜區的核苷酸序列為SEQ ID NO.6所示；

4-1BB胞內區的核苷酸序列為SEQ ID NO.7所示；

CD3ζ胞內區的核苷酸序列為SEQ ID NO.8所示。

2.如權利要求1所述的抗VEGF基因，其特征在于：其基因片段為序列表 SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

3.利用如權利要求2所述抗VEGF基因修飾的T細胞，其特征在于：所述T細胞為單核細胞誘導的異質T細胞，且經過攜帶有所述抗VEGF基因的慢病毒感染得到。

4.根據權利要求3所述的T細胞的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)將導引子、VEGF抗原結合區、CD3抗原結合區、CD8的Hinge區、CD8的跨膜區與共刺激分子合成其整個表達框，插入pLent-C-GFP載體BamHI-NotI位點，轉化到E.coli，測序正確后，使用質粒提取試劑盒提取質粒，獲得重組表達載體pLent-AntiVEGF-CD3；

2)取外周血，分離外周血單個核細胞；用重組干擾素α2a的培養基誘導培養后，加入重組白細胞介素2、OKT-3和同體血漿誘導繼續培養；每隔三天倍比加液，培養至第14天，流式細胞術檢測T細胞中的CD3+陽性率 80％，CD3+CD56+雙陽性率 20％，視為T細胞誘導成功，并留取該異質T細胞待病毒感染；

3)復蘇293T細胞，步驟1)得到的重組表達載體pLent-AntiVEGF-CD3與慢病毒包裝質粒采用脂質體轉染法轉染293T細胞，獲得pLent-AntiVEGF-CD3慢病毒；

4)將步驟3)得到的所述pLent-AntiVEGF-CD3慢病毒感染步驟2)制得的異質T細胞，獲得抗VEGF基因修飾的T細胞。

5.如權利要求3所述的T細胞在制備治療腫瘤藥物中的應用。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于：在制備治療肝癌的藥物中的應用。

7.如權利要求5所述的應用，其特征在于：所用T細胞的數量為0.5×10⁶-1×10⁹/kg。