[發明專利]一種重組抗TNF-α全人源單克隆抗體的制備方法

在審

• 申請號: 201711144785.X
• 申請日: 2017-11-17
• 公開（公告）號: CN108164601A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 王強
• 申請（專利權）人: 安徽未名生物醫藥有限公司
• 主分類號: C07K16/24
• 分類號: C07K16/24;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 合肥市長遠專利代理事務所(普通合伙) 34119
• 代理人: 楊霞;翟攀攀

本發明公開了一種重組抗TNF?α全人源單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：合成重組抗TNF?α全人源單克隆抗體的核酸序列；利用所得重組抗TNF?α全人源單克隆抗體的核酸序列構建載體，轉染宿主細胞，篩選高表達的細胞克隆，建立細胞庫；利用所得細胞株進行培養，分離純化，獲得重組抗TNF?α全人源單克隆抗體。本發明根據中國倉鼠偏愛密碼子設計合成重組抗TNF?α全人源單克隆抗體的輕鏈、重鏈，構建真核表達載體，轉染宿主細胞CHO?GS^?，并采用無血清培養技術培養，分離純化，獲得高純度的重組抗TNF?α全人源單克隆抗體。本發明制備方法操作簡單，生產周期短，適于工業化生產。

技術領域

本發明涉及單克隆抗體技術領域，尤其涉及一種重組抗TNF-α全人源單克隆抗體的制備方法。

背景技術

類風濕關節炎(Rheumatoid Rrthritis，RA)，是以關節滑膜的炎癥為主要特征的一種慢性、侵蝕性、對稱性、小關節、多關節為主的全身性自身免疫病，嚴重影響患者的生活質量。

TNF-α是促使滑膜炎癥發生的常見細胞因子，在發病機制的網絡中居于重要位置。TNF-α是一種多效性前炎癥因子，在炎癥反應過程中出現最早、最重要的炎癥介質之一：以自分泌和旁分泌方式激活單核巨噬細胞，使其產生大量IL-1、IL-6、IL-8等促炎癥因子，引起級聯反應，放大信號傳導；還可以進一步激發體內細胞間黏附因子(ICAM)的高度表達，導致組織內抗原不能被及時遏制或清除；可聯合其他類分濕因子與抗原形成較大的抗原-抗體復合物，并在關節腔內沉積，進一步難以清除。最終造成正常組織損傷，關節腫大，彎曲變形。

阿達木單抗(Adalimumab)，商品名為修美樂(Humira)，是一種抗TNF-α的人源化抗體產品，于2002年被FDA批準用于治療類風濕性關節炎(RA)和強直性脊柱炎(AS)，可特異性地與TNF-α結合并阻斷其與p55和p75細胞表面TNF受體的相互作用，從而阻斷炎癥反應的產生，對于慢性炎癥疾病具有顯著效果。

目前，單克隆抗體以細胞工程技術和基因工程技術為主體的抗體工程技術為制備手段已是一種常規方法，而治療性單抗藥物也已成為生物技術藥物的熱點，現行的四代抗體技術-全人源化也日漸成為一種趨勢。但面對國外針對阿達木單抗的技術壟斷，國內仿制藥行業技術手段水平參差不一，造成抗體的表達量、穩定性、效價等結果差異明顯，國內抗體藥水平始終落后于國外公司，國內患者的生活質量不能得到有效保障。

發明內容

基于背景技術存在的技術問題，本發明的目的在于提供一種重組抗TNF-α全人源單克隆抗體的制備方法。本發明發現，通過對表達載體進行改造和優化，將有可能獲得重組抗TNF-α全人源單克隆抗體的高效表達和結構穩定。本發明中采用無血清分批補料式培養方式，防止了交叉污染、病毒污染，保證了產品質量。

本發明提出的一種重組抗TNF-α全人源單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

a)合成重組抗TNF-α全人源單克隆抗體的核酸序列；重組抗TNF-α全人源單克隆抗體具有輕鏈和重鏈，其中輕鏈的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，輕鏈的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；重鏈的可變區的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，重鏈的可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

b)利用步驟a)所得重組抗TNF-α全人源單克隆抗體的核酸序列構建載體pHL101-GS/Neo，轉染宿主細胞，篩選高表達的細胞克隆，建立細胞庫；

c)利用步驟b)所得細胞株進行培養，分離純化，獲得重組抗TNF-α全人源單克隆抗體。

優選地，步驟a)中，采用中國倉鼠卵巢細胞的偏愛密碼子合成重組抗TNF-α全人源單克隆抗體的核酸序列。

優選地，步驟b)中，所述構建載體過程中，包括構建表達重鏈的載體、構建表達輕鏈的載體、構建雙真核啟動子驅動表達重鏈和輕鏈的載體。