[發明專利]一種通路克隆入門載體的構建方法

在審

• 申請號: 201711138520.9
• 申請日: 2017-11-16
• 公開（公告）號: CN107699586A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 張可偉;張艷軍;趙江哲;趙利;張夢園
• 申請（專利權）人: 浙江師范大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66
• 代理公司: 南京業騰知識產權代理事務所(特殊普通合伙)32321
• 代理人: 李靜

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種快速高效低成本構建通路克隆(Gateway)技術的入門載體的構建方法。

背景技術

載體構建是分子生物學和基因工程研究中必不可少的環節，是功能基因組研究的基本技術。隨著分子技術的不斷發展，目前已建立了多種載體構建方法，主要包括：傳統的酶切連接法、重疊延伸PCR法、一步克隆法、In-Fusion試劑盒法、不依賴序列和連接的同源重組方法(Sequence and ligation-independent cloning，SLIC)和Gateway技術等。其中，Invitrogen公司開發的Gateway技術以λ噬菌體的位點特異重組系統為基礎，首先利用BP反應(一個attBDNA片段或表達克隆和一個attP供體載體之間的重組反應)或TOPO克隆將擴增的PCR片段構建至Gateway入門載體，再通過LR反應(一個attL入門克隆和一個attR目的載體之間的重組反應)將目的片段從入門載體克隆至不同功能的Gateway目的載體中，該方法具有以下優點：1)不受限制性內切酶酶切位點的限制；2)入門載體通用于不同目標載體；3)構建過程簡單快速且定向插入，從而大大提高了實驗效率。目前Invitrogen公司開發了多種可供選擇的Gateway目的載體，同時研究人員也開發了很多與Gateway技術兼容的載體系統，如Mark等構建了與Gateway技術兼容的農桿菌雙元表達載體pMDC系列載體，非常方便用于植物功能基因組研究，包括基因表達、蛋白亞細胞定位、蛋白互作、啟動子表達分析等系列分子生物學試驗。

目前構建入門載體有三種方法，一種方法是通過BP反應將PCR片段重組到pDONR和pENTR等系列載體，載體可以重復使用但是BP重組酶價格昂貴，而且插入片段長于2KB時效率會大大降低；第二種方法是利用TOPO克隆或TA克隆方法將PCR產物連接到pENTR/D-TOPO和pCR8/GW/TOPO等載體，但是這些入門載體價格昂貴，且不能夠復制和反復使用，大大增加了實驗成本；第三種方法是利用限制性內切酶將PCR片段連到入門載體，如Fu等構建的GEC和PEC載體，該方法成本低廉，但是常受限于載體上的酶切位點，而且耗時過長。因此開發一種快速高效低成本構建通路克隆入門載體的方法對于推廣通路克隆應用有著重要意義。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中構建通路克隆入門載體存在的問題，提供一種通路克隆入門載體的構建方法，該方法省時，成本低，操作簡單，成功率高，該方法構建的入門載體可以反復保存和反復使用，可兼容于具有attR序列的目標載體，用于功能基因組學和基因工程的研究和應用。

技術方案

一種通路克隆入門載體的構建方法，包括如下步驟：

(1)引物設計

根據pCR8載體和水稻異分支酸合成酶基因的啟動子(ICS1pro)序列設計基因擴增引物ICS1pro-F1和ICS1pro-R1，根據水稻異分支酸合成酶基因的啟動子(ICS1pro)基因序列設計菌落PCR引物ICS1pro-F2和ICS1pro-R2；

(2)ICS1pro片段的擴增與純化

以CTAB方法提取的日本晴的DNA為模板進行PCR基因擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并利用膠回收試劑盒純化回收PCR產物，即得ICS1pro片段；

(3)pCR8片段的獲得

采用通路克隆入門載體pCR8-AtS5H作為原始載體，利用限制性內切酶EcoRI對其進行單酶切，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并利用膠回收試劑盒對割膠產物進行回收，得到pCR8片段；

(4)pCR8-ICS1pro質粒的構建

利用SLIC法將回收的ICS1pro片段和pCR8片段進行連接，其中ICS1pro片段和pCR8片段的摩爾比為2:1，26℃金屬浴孵育2.5min，然后立即置于冰中10min，取反應產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(熱激法)，采用菌落PCR驗證和測序進行鑒定，從而最終得到陽性入門克隆載體pCR8-ICS1pro。

進一步，步驟(1)中，所述水稻采用日本晴。

進一步，步驟(1)中，所述基因擴增引物ICS1pro-F1：

5’-GCAGGCTCCGAATTCTGGCTTGGGTAGGATTATG-3’；

引物ICS1pro-R1：5’-AAGCTGGGTCGAATTCCGGGTGGGAGGAGGAAGAAG-3’；