[發(fā)明專利]一種通路克隆入門載體的構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711138520.9
• 申請日: 2017-11-16
• 公開（公告）號: CN107699586A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張可偉;張艷軍;趙江哲;趙利;張夢園
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江師范大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66
• 代理公司: 南京業(yè)騰知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(特殊普通合伙)32321
• 代理人: 李靜

1.一種通路克隆入門載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)引物設(shè)計

根據(jù)pCR8載體和水稻異分支酸合成酶基因的啟動子序列設(shè)計基因擴增引物ICS1pro-F1和ICS1pro-R1，根據(jù)水稻異分支酸合成酶基因的啟動子序列設(shè)計菌落PCR引物ICS1pro-F2和ICS1pro-R2；

(2)ICS1pro片段的擴增與純化

以CTAB方法提取的日本晴DNA為模板進行PCR基因擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并利用膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，即得ICS1pro片段；

(3)pCR8片段的獲得

采用通路克隆入門載體pCR8-AtS5H作為原始載體，利用限制性內(nèi)切酶EcoRI對其進行單酶切，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并利用膠回收試劑盒對割膠產(chǎn)物進行回收，得到pCR8片段；

(4)pCR8-ICS1pro質(zhì)粒的構(gòu)建

利用一步SLIC法將回收的ICS1pro片段和pCR8片段進行連接，其中ICS1pro片段和pCR8片段的摩爾比為2:1，26℃金屬浴孵育2.5min，然后立即置于冰中10min，取反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，采用菌落PCR驗證和測序進行鑒定，從而最終得到陽性入門克隆載體pCR8-ICS1pro；

步驟(1)中，所述水稻采用日本晴。

2.如權(quán)利要求1所述的通路克隆入門載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中，所述基因擴增引物ICS1pro-F1：5’-GCAGGCTCCGAATTCTGGCTTGGGTAGGATTATG-3’；

引物ICS1pro-R1：5’-AAGCTGGGTCGAATTCCGGGTGGGAGGAGGAAGAAG-3’；

菌落PCR引物ICS1pro-F2：5’-TTGGCTTGGGTAGGATTA-3’；

菌落PCR引物ICS1pro-R2：5’ACGAAGGAGCGAAGGTTA-3’。

3.如權(quán)利要求1所述的通路克隆入門載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR反應體系為(總體積50μL)：2×PCR Buffer for KOD FX 25μL，2mM dNTP 10μL，10mM引物ICS1pro-F11.5μL，10mM引物ICS1pro-R11.5μL，KOD FX 1μL，DNA 1μL，ddH₂O 10μL。

4.如權(quán)利要求1所述的通路克隆入門載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR反應條件為：94℃預變性3min；98℃變性10s、55℃退火30s，68℃延伸3min，共30個循環(huán)；68℃延伸10min。

5.如權(quán)利要求1所述的通路克隆入門載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)中，所述單酶切的反應體系為：10×H Buffer 5μL，EcoR I 2.5μL，pCR8-AtS5H質(zhì)粒(100ng/μL)20μL，ddH₂O 22.5μL；37℃下酶切3h。

6.如權(quán)利要求1所述的通路克隆入門載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(4)中，利用SLIC法將回收的ICS1pro片段和pCR8片段進行連接的反應體系為：10×NEB Buffer 21μL、100×BSA 0.1μL、ICS1pro片段(80ng/μl)3μL、pCR8片段(30ng/μl)4μL、ddH₂O 1.9μL、T4 DNA polymerase 0.2μL。

7.如權(quán)利要求1至6任一項所述的通路克隆入門載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述菌落PCR驗證的反應體系包括2×Taq Master Mix 5μL、10mM引物ICS1pro-F2 1μL、10mM引物ICS1pro-R2 1μL和ddH₂O 3μL；反應條件為：94℃預變性3min；94℃變性30s、55℃退火30s，72℃延伸1min，共32個循環(huán)；72℃延伸10min。