[發明專利]一種Y染色體微缺失的檢測方法及其引物組

在審

• 申請號: 201711137294.2
• 申請日: 2017-11-16
• 公開（公告）號: CN109797210A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 裘敏燕
• 申請（專利權）人: 上海聯吉醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及分子生物學基因技術領域和醫學領域，具體公開了一種用于檢測Y染色體微缺失的方法及其引物組。本發明對AZFasY84、AZFasY86、AZFasY127、AZFasY134、AZFasY254、AZFasY255、SRYsY14這7個序列標簽位點的核酸序列進行分析，設計相應的引物，對樣本基因組DNA特定位點經過多重PCR擴增，最后以Ion Torrent半導體芯片測序技術進行檢測。本發明的檢測方法具有通量大，特異性及靈敏度高，結果穩定，重復性好，檢測速度快等優點。為男性缺精、少精不育的遺傳學方面的檢測、測試、分析和評估提供了一條快速、可靠、準確的新途徑，從而為該類疾病的臨床診斷提供理論基礎。

技術領域

本發明涉及分子生物學基因技術領域和醫學領域，涉及用分子生物學方法對Y染色體微缺失相關基因序列標簽位點檢測的引物組，特別涉及用Ion Torrent半導體芯片測序技術對Y染色體微缺失進行定性、定量檢測的相關引物組及其試劑盒。

背景技術

男性不育的發病率很高，大約每20個男子中就有一個患男性不育的。究其原因，多為缺精、少精所致不育。按照WHO標準進行2次以上的精液常規分析，可分為無精癥，嚴重少精癥 (精子密度<5×10⁶／m1)、少精癥 (精子密度<20×10⁶／m1)以及密度正常的弱精癥(精子密度>20×10⁶／ml，精子活率<50％)四大類。導致男性不育的病因很多，除了炎癥引起的器質性病變，精索靜脈曲張，隱睪，Klinefelter綜合征以及阻塞性無精癥等因素所致的缺精少精外，Y染色體上的精子生成因子（azoospermia factor，AZF）座位微缺失則是導致男性不育的一個重要的遺傳因素。是繼Klinefelter綜合征之后導致男性不育的第二大高發因素。

精子生成因子AZF是一組位于Y染色體長臂上的基因家族，分為近端AZFa、中端AZFb、遠端AZFc三個區域，其中任何一個區域的微缺失都能導致精子生成障礙。

根據歐洲男性科學學會（EAA）推薦的標準，確定AZF基因家族是否存在微缺失要設置6個序列標志位點（sequence tagged sites， STS）引物，每個區域位點分別有兩個STS引物，分別是AZFa: sY84, sY86；AZFb: sY127, sY134；AZFc: sY254, sY255。同時還要設立一個確定男性性別的標志性基因SYR。

目前已報道的用于遺傳性男性不育的檢測主要是復合PCR及瓊脂糖凝膠電泳的方法，存在假陰性的幾率較高。

Ion Torrent半導體芯片測序技術是新一代的測序技術，它的核心技術是使用半導體技術在化學和數字信息之間建立直接的聯系。在半導體芯片的微孔中的微球上固定DNA鏈，隨后依次摻入單核苷酸dGTP、dCTP、dATP、dTTP。隨著每個堿基的摻入，釋放出H⁺，H⁺在它們穿過每個孔底部時能被檢測到，通過對H⁺的檢測，實時判讀堿基。由于其化學測序原理自然簡單，無修飾的核苷酸、無激光器或光學檢測設備，因而可達到極小的測序偏差和出色的測序覆蓋均衡度，一臺儀器即可適合各種測序通量需求的科學研究，在較短的時間內獲得真實可靠的實驗結果。

Ion Torrent半導體芯片測序技術與傳統Sanger法及二代測序技術比較，IonTorrent技術有以下優勢：系統無激光光源，無光學系統，無照相系統；使用無標記的核苷酸及酶進行測序，本底干擾低；通過對 H⁺的檢測，可以改善堿基判讀準確性；測序通量大、速度快，完成1G通量的測序檢測僅需2~3小時，是傳統Sanger測序方法通量的數千倍以上，同時彌補了已有二代高通量測序方法工作時間過長的缺陷。

目前尚沒有報道Ion Torrent半導體芯片測序技術專門用于Y染色體微缺失相關基因序列標簽位點的檢測。

發明內容