[發(fā)明專利]一種磷脂酶A1輔助蛋白PlaS的表達(dá)及純化方法

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• 申請日: 2017-11-16
• 公開（公告）號: CN108004261A
• 公開（公告）日: 2018-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 薛正蓮;朱昊;王洲;劉艷;陳阿娜;楊蒙;甘玉飛
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽工程大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/00;C07K1/14
• 代理公司: 北京東方靈盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11506
• 代理人: 蘇向銀

本發(fā)明提供一種磷脂酶A1輔助蛋白PlaS的表達(dá)方法，將磷脂酶A1輔助蛋白plaS基因N端去除信號肽，得到截短輔助蛋白，然后構(gòu)建大腸桿菌/截短輔助蛋白表達(dá)菌株，將表達(dá)菌株接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明人采用N端截短技術(shù)，將plaS基因N端截短35AA，并成功構(gòu)建了BL21/dSP28表達(dá)菌株，使輔助蛋白進(jìn)行大量表達(dá)。且通過對表達(dá)培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，獲得了能夠使目的蛋白大量可溶表達(dá)并易純化的培養(yǎng)基。然后采用不同純化方式對目的蛋白進(jìn)行純化，確定了最佳純化方法。該培養(yǎng)基使目的蛋白在破碎上清中大量可溶性表達(dá)，減少了在蛋白純化過程中變復(fù)性的繁瑣操作，純化方法提高了蛋白得率，使純化過程更為簡便。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磷脂酶A1輔助蛋白PlaS的表達(dá)及純化方法。

背景技術(shù)

磷脂酶A1是生物體內(nèi)重要的一類水解酶，水解磷脂生成溶血磷脂和自由脂肪酸,在工業(yè)上得到了廣泛的應(yīng)用，主要在植物脫膠、食品行業(yè)、制藥行業(yè)等等。粘質(zhì)沙雷氏菌中磷脂酶A1中還存在一個與磷脂酶A1酶活、分泌和對宿主菌生長都存在作用的蛋白，這個蛋白質(zhì)被稱為磷脂酶A1的輔助蛋白質(zhì)PlaS。安徽工程大學(xué)蘇燕南等在研究粘質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)磷脂酶A1的過程中發(fā)現(xiàn)：在磷脂酶A1編碼基因plaA的下游存在一段輔助蛋白編碼序列plaS，它與磷脂酶A1在大腸桿菌中的高活性表達(dá)密切，同時顯示對宿主細(xì)胞有抑制作用，具體內(nèi)容見中國專利CN103333229。目前，國內(nèi)外對磷脂酶A1輔助蛋白PlaS的相關(guān)研究報道較少。安徽工程大學(xué)張爽等在前期實驗中發(fā)現(xiàn)輔助蛋白plaS基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中構(gòu)建成功后很難表達(dá)，僅通過Western Blot檢測技術(shù)，才見有少量表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種磷脂酶A1輔助蛋白PlaS的表達(dá)及純化方法。通過對磷脂酶A1輔助蛋白N端截短，使其大量表達(dá)，并能在SDS-PAGE電泳中檢測。再通過改變培養(yǎng)基條件，篩選出目的蛋白表達(dá)量大且易純化的培養(yǎng)基，從而得到磷脂酶A1輔助蛋白PlaS。本發(fā)明方法簡便，快捷，實驗成本較低，適用于大部分實驗室。

本發(fā)明提供一種磷脂酶A1輔助蛋白PlaS的表達(dá)方法，將磷脂酶A1輔助蛋白plaS基因N端去除信號肽，得到截短輔助蛋白，然后構(gòu)建大腸桿菌/截短輔助蛋白表達(dá)菌株，將表達(dá)菌株接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。

作為優(yōu)選方案，所述進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)是將表達(dá)菌株接種至含有TB的培養(yǎng)基或乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

作為優(yōu)選方案，所述含有TB的培養(yǎng)基為TB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基+0.98wt％甘油+0.75wt％甘氨酸或TB培養(yǎng)基+1-3wt％甘油。

作為優(yōu)選方案，所述含有TB的培養(yǎng)基為TB培養(yǎng)基+3wt％甘油。

作為優(yōu)選方案，在目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后，制備破碎上清蛋白。

作為優(yōu)選方案，所述截短輔助蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQ ID No.4。

本發(fā)明還提供一種磷脂酶A1輔助蛋白PlaS的純化方法，應(yīng)用權(quán)利要求1-6任一項表達(dá)方法將磷脂酶A1輔助蛋白PlaS進(jìn)行表達(dá)，然后純化。

作為優(yōu)選方案，所述純化為用磁珠純化或用AKTA系統(tǒng)過鎳柱純化。

作為優(yōu)選方案，所述純化為用AKTA系統(tǒng)過鎳柱純化。

作為優(yōu)選，所述用AKTA系統(tǒng)過鎳柱純化時結(jié)合緩沖液配方為：20mM磷酸鈉，0.5MNaCl，20mM咪唑，pH 7.4；洗脫緩沖液配方為20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4。