[發明專利]一種分子信標探針檢測人類CYP2C9基因多態性的試劑盒、方法及其應用

在審

• 申請號: 201711136931.4
• 申請日: 2017-11-16
• 公開（公告）號: CN107653317A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 任緒義;張鋒
• 申請（專利權）人: 黑龍江迪安醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙)11427
• 代理人: 陳娟

技術領域

本發明屬于基因檢測技術領域，具體涉及一種分子信標探針檢測人類CYP2C9基因多態性的試劑盒、方法及其應用。

背景技術

CYP2C9是細胞色素P450酶(CYP)第二亞家族中的重要成員，是人體重要的藥物代謝酶；CYP2C9能羥化代謝許多不同性質的藥物，據統計，目前約有16％的臨床藥物由CYP2C9負責代謝。CYP2C9參與抗凝血藥、抗驚厥藥、降糖藥、非甾體類解熱鎮痛抗炎藥、抗高血壓藥以及利尿藥等多種藥物的羥化代謝，其中華法林、甲苯磺丁脲和苯妥因均為治療指數較窄的藥物。CYP2C9活性變化可導致這些藥物體內濃度出現較大變化，甚至導致嚴重藥物不良反應的發生。CYPC2C9*2(rs1799853，C430T，Arg144Cys)和CYP2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)均導致CYP2C9酶活性降低，CYP2C9*3純合子個體酶活性僅為該位點野生型純合子基因型個體(攜帶CYP2C9*1或Arg144/Ile359等位基因)的4～6％。中國人群中CYPC2C9*2的頻率為0％，CYPC2C9*3的頻率為3％。CYP2C9遺傳多態性導致其酶活性變化，從而導致藥物代謝種族和個體差異化現象。

華法林是臨床上常用的抗凝藥物，是深靜脈血栓、心房纖顫、心臟瓣膜置換術和肺栓塞等疾病的一線用藥，其臨床療效和不良反應存在很大的個體差異，血藥濃度過高或敏感性增加可導致嚴重出血事件。華法林由S-和R-兩種消旋體構成，其中S-華法林的抗凝活性約為R-華法林的5倍。85％以上的S-華法林在體內經CYP2C9代謝為無活性的代謝產物，CYP2C9*3純合子和雜合子基因型個體S-華法林的口服清除率分別下降90％和66％，因此華法林的給藥劑量需相應降低。美國FDA已批準修改華法林產品說明書，推薦在使用華法林前進行CYP2C9基因檢測。測定CYP2C9*3等位基因可用于指導中國人群確定華法林的起始用藥劑量，并預測藥物毒性，結合國際標準化比值(International normalized ratio，INR)檢測值，估計華法林的維持劑量，確保用藥安全。

目前針對多態性位點分析的方法主要有熒光定量PCR(qPCR)、PCR-限制性片段長度多態性(PCR-Restriction Length Polymorphism，PCR-RFLP)、擴增阻滯突變系統-PCR(Amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR)等，但是由于這些方法操作步驟多，費時費力，或者需要PCR后處理，易產生污染，因此不適用于人群大規模的快速檢測。測序法是核酸測序的金標準，雖然準確，但是操作步驟繁瑣且成本較高。本發明，接觸非對稱PCR、分子信標技術和溶解曲線分析技術，發明了一種快速、準確的基因分型方法和試劑盒。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種分子信標探針結合溶解曲線法檢測人類CYP2C9基因多態性的試劑盒、方法及其應用。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種分子信標探針結合溶解曲線法檢測人類CYP2C9基因多態性的引物，包括如下核酸序列：

(1)擴增CYP2C9基因rs1799853多態性位點的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2所示；擴增CYP2C9基因rs1057910多態性位點的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：3和SEQ ID NO.：4所示；

(2)用于檢測CYP2C9基因rs1799853多態性位點的探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：5所示，其中探針的5末端標記FAM，3末端標記DABSYL；用于檢測CYP2C9基因rs1057910多態性位點的分子信標序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：6所示，其中探針的5末端標記HEX，3末端標記DABSYL。

上述引物對和熒光探針對在一次檢測中共同使用。

上述分子信標探針結合溶解曲線法檢測人類CYP2C9基因多態性的引物和探針在檢測CYP2C9基因多態性中的應用在本發明的保護范圍之內。

一種分子信標探針結合溶解曲線法用于檢測人類CYP2C9基因多態性的試劑盒，該試劑盒包括上述引物和探針、2x PCR反應混合液，陽性標準品。

一種分子信標探針結合溶解曲線法用于檢測人類CYP2C9基因多態性的方法，包括如下步驟：

(1)提取人外周血基因組DNA；