[發(fā)明專利]一種分子信標(biāo)探針檢測(cè)人類CYP2C9基因多態(tài)性的試劑盒、方法及其應(yīng)用在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201711136931.4 | 申請(qǐng)日: | 2017-11-16 |
| 公開(kāi)(公告)號(hào): | CN107653317A | 公開(kāi)(公告)日: | 2018-02-02 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 任緒義;張鋒 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 黑龍江迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司 |
| 主分類號(hào): | C12Q1/6883 | 分類號(hào): | C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/11 |
| 代理公司: | 北京科家知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11427 | 代理人: | 陳娟 |
| 地址: | 150001 黑龍江省哈爾濱*** | 國(guó)省代碼: | 黑龍江;23 |
| 權(quán)利要求書(shū): | 查看更多 | 說(shuō)明書(shū): | 查看更多 |
| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 一種 分子 信標(biāo) 探針 檢測(cè) 人類 cyp2c9 基因 多態(tài)性 試劑盒 方法 及其 應(yīng)用 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種分子信標(biāo)探針檢測(cè)人類CYP2C9基因多態(tài)性的試劑盒、方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
CYP2C9是細(xì)胞色素P450酶(CYP)第二亞家族中的重要成員,是人體重要的藥物代謝酶;CYP2C9能羥化代謝許多不同性質(zhì)的藥物,據(jù)統(tǒng)計(jì),目前約有16%的臨床藥物由CYP2C9負(fù)責(zé)代謝。CYP2C9參與抗凝血藥、抗驚厥藥、降糖藥、非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥、抗高血壓藥以及利尿藥等多種藥物的羥化代謝,其中華法林、甲苯磺丁脲和苯妥因均為治療指數(shù)較窄的藥物。CYP2C9活性變化可導(dǎo)致這些藥物體內(nèi)濃度出現(xiàn)較大變化,甚至導(dǎo)致嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。CYPC2C9*2(rs1799853,C430T,Arg144Cys)和CYP2C9*3(rs1057910,A1075C,Ile359Leu)均導(dǎo)致CYP2C9酶活性降低,CYP2C9*3純合子個(gè)體酶活性僅為該位點(diǎn)野生型純合子基因型個(gè)體(攜帶CYP2C9*1或Arg144/Ile359等位基因)的4~6%。中國(guó)人群中CYPC2C9*2的頻率為0%,CYPC2C9*3的頻率為3%。CYP2C9遺傳多態(tài)性導(dǎo)致其酶活性變化,從而導(dǎo)致藥物代謝種族和個(gè)體差異化現(xiàn)象。
華法林是臨床上常用的抗凝藥物,是深靜脈血栓、心房纖顫、心臟瓣膜置換術(shù)和肺栓塞等疾病的一線用藥,其臨床療效和不良反應(yīng)存在很大的個(gè)體差異,血藥濃度過(guò)高或敏感性增加可導(dǎo)致嚴(yán)重出血事件。華法林由S-和R-兩種消旋體構(gòu)成,其中S-華法林的抗凝活性約為R-華法林的5倍。85%以上的S-華法林在體內(nèi)經(jīng)CYP2C9代謝為無(wú)活性的代謝產(chǎn)物,CYP2C9*3純合子和雜合子基因型個(gè)體S-華法林的口服清除率分別下降90%和66%,因此華法林的給藥劑量需相應(yīng)降低。美國(guó)FDA已批準(zhǔn)修改華法林產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),推薦在使用華法林前進(jìn)行CYP2C9基因檢測(cè)。測(cè)定CYP2C9*3等位基因可用于指導(dǎo)中國(guó)人群確定華法林的起始用藥劑量,并預(yù)測(cè)藥物毒性,結(jié)合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(International normalized ratio,INR)檢測(cè)值,估計(jì)華法林的維持劑量,確保用藥安全。
目前針對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)分析的方法主要有熒光定量PCR(qPCR)、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-Restriction Length Polymorphism,PCR-RFLP)、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)-PCR(Amplification refractory mutation system PCR,ARMS-PCR)等,但是由于這些方法操作步驟多,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,或者需要PCR后處理,易產(chǎn)生污染,因此不適用于人群大規(guī)模的快速檢測(cè)。測(cè)序法是核酸測(cè)序的金標(biāo)準(zhǔn),雖然準(zhǔn)確,但是操作步驟繁瑣且成本較高。本發(fā)明,接觸非對(duì)稱PCR、分子信標(biāo)技術(shù)和溶解曲線分析技術(shù),發(fā)明了一種快速、準(zhǔn)確的基因分型方法和試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種分子信標(biāo)探針結(jié)合溶解曲線法檢測(cè)人類CYP2C9基因多態(tài)性的試劑盒、方法及其應(yīng)用。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種分子信標(biāo)探針結(jié)合溶解曲線法檢測(cè)人類CYP2C9基因多態(tài)性的引物,包括如下核酸序列:
(1)擴(kuò)增CYP2C9基因rs1799853多態(tài)性位點(diǎn)的引物對(duì),其核苷酸序列如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示;擴(kuò)增CYP2C9基因rs1057910多態(tài)性位點(diǎn)的引物對(duì),其核苷酸序列如SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示;
(2)用于檢測(cè)CYP2C9基因rs1799853多態(tài)性位點(diǎn)的探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示,其中探針的5末端標(biāo)記FAM,3末端標(biāo)記DABSYL;用于檢測(cè)CYP2C9基因rs1057910多態(tài)性位點(diǎn)的分子信標(biāo)序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示,其中探針的5末端標(biāo)記HEX,3末端標(biāo)記DABSYL。
上述引物對(duì)和熒光探針對(duì)在一次檢測(cè)中共同使用。
上述分子信標(biāo)探針結(jié)合溶解曲線法檢測(cè)人類CYP2C9基因多態(tài)性的引物和探針在檢測(cè)CYP2C9基因多態(tài)性中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
一種分子信標(biāo)探針結(jié)合溶解曲線法用于檢測(cè)人類CYP2C9基因多態(tài)性的試劑盒,該試劑盒包括上述引物和探針、2x PCR反應(yīng)混合液,陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。
一種分子信標(biāo)探針結(jié)合溶解曲線法用于檢測(cè)人類CYP2C9基因多態(tài)性的方法,包括如下步驟:
(1)提取人外周血基因組DNA;
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