[發(fā)明專利]一種通過轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法

在審

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• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107937412A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張美善
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種通過轉(zhuǎn)基因調(diào)高玉米抗旱性的方法。

背景技術(shù)

玉米是重要的糧食作物和飼料作物，也是全世界總產(chǎn)量最高的農(nóng)作物。隨著飼料與工業(yè)需求的增加，玉米需求呈強勁地增長態(tài)勢，當前中國已從玉米凈出口轉(zhuǎn)變?yōu)橛衩變暨M口。至2011年，玉米的播種面積已超過水稻，成為中國第一大農(nóng)作物品種(王全忠等，2016)。玉米生長中需水量較大，在整個生長周期內(nèi)，一般需要至少2500mm的降水量，而且生長期內(nèi)的需水量變化很大，除苗期可適當干旱(蹲苗)外，從拔節(jié)到成熟都應(yīng)保證良好的水分供應(yīng)(王士謙，2005)。我國每年種植的玉米面積中，受到干旱影響的面積占了大約60％，造成減產(chǎn)20％-30％(高志勇等，2016)。因此通過玉米抗旱的遺傳和生理基礎(chǔ)研究，挖掘抗旱相關(guān)基因資源，培育高抗旱性玉米品系，對我國玉米生產(chǎn)具有重要意義。

染色質(zhì)重塑是在維持基因組穩(wěn)定性、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達調(diào)控中起關(guān)鍵作用。Kim等通過染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)分析發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可誘導RD29A和RD29B基因啟動子處核小體密度降低和H3K4me3與H3K9ac修飾的升高，而該區(qū)域包含一個關(guān)鍵的脅迫應(yīng)答因子ABRE(ABA-responsive element)的結(jié)合位點，促使脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子如DREB、ABRE等迅速招募到基因啟動子處，激活RD29A和RD29B基因表達；在鹽脅迫時，DREB2A、RD29A和RD29B基因的組蛋白H3K9me2水平降低、H3K4me3水平升高，在從而調(diào)節(jié)了這些基因的表達，以適應(yīng)脅迫環(huán)境(Kim et al.，2008；Kim et al.，2012)。相反的，在同樣的條件下，這些相關(guān)位點的核小體定位(nucleosome occupancy)急劇下降(Kim et al.，2010)，說明染色質(zhì)重塑和組蛋白修飾需要密切的協(xié)調(diào)，從而調(diào)控基因表達(tightly coordinated to regulate gene expression)。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種通過轉(zhuǎn)基因調(diào)高玉米抗旱性的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種通過轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，通過將CHB101基因的編碼區(qū)轉(zhuǎn)入到玉米基因組中，在玉米葉片中誘導表達CHB101基因，即然后利用Ubi啟動子組成型表達CHB101基因，從而促進葉片氣孔在干旱條件下快速閉合，有利于玉米植株保持水分，從而提高玉米的抗旱性，同時還不會影響玉米在正常水分條件下的生長發(fā)育，提高玉米的抗旱性。具體包括如下步驟：

S1、總RNA的提取：

S11、取4葉期玉米葉片剪碎液氮研磨成粉，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管內(nèi)，加入1ml Trizol，充分混勻，室溫放置5-10分鐘后，加入RNAiso Plus的1/5體積量的氯仿，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15秒(氯仿沸點低、易揮發(fā)，振蕩時應(yīng)小心離心管蓋突然彈開)，待溶液充分乳化，無分相現(xiàn)象后，再室溫靜置5分鐘；12,000g 4℃離心15分鐘；

S12、從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即：無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相；吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，切忌吸出白色中間層；

S13、向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15～30℃下靜置10分鐘后，12,000g 4℃離心10分鐘，小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75％的乙醇1ml(切勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12,000g 4℃離心5分鐘后小心棄去乙醇(為了更好地控制RNA中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇)；

S14、室溫干燥沉淀2～5分鐘，使酒精完全揮發(fā)后，用10-15μl DEPC-H2O溶解RNA，視沉淀量而定；

S2、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自INVITROGEN公司，實驗操作如下：

S21、用DNaseI處理RNA，10μl反應(yīng)體系包含：

DNaseI 1μl；

DNaseI buffer 1μl；

RNA 10μg；

DEPC-H2O up to 10μl；

輕輕混勻后瞬時離心，室溫放置15min后，加入1μl 25mM的EDTA，65℃處理10min，使DNaseI失活；

S22、在冰上于PCR管中加入以下試劑：

0.5μg/μl的oligo dTnV 1μl；