[發(fā)明專利]一種通過轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711134682.5
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107937412A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張美善
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
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1.一種通過轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，通過將CHB101基因的編碼區(qū)轉(zhuǎn)入到玉米基因組中，然后利用Ubi啟動子組成型表達(dá)CHB101基因，從而提高玉米的抗旱性。

2.如權(quán)利要求1所述的一種通過轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、總RNA的提取：

S11、取4葉期玉米葉片剪碎液氮研磨成粉，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管內(nèi)，加入1ml Trizol，充分混勻，室溫放置5-10分鐘后，加入RNAiso Plus的1/5體積量的氯仿，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15秒，待溶液充分乳化，無分相現(xiàn)象后，再室溫靜置5分鐘；12,000g 4℃離心15分鐘；

S12、從離心機(jī)中小心取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，切忌吸出白色中間層；

S13、向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15～30℃下靜置10分鐘后，12,000g 4℃離心10分鐘，小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75％的乙醇1ml，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12,000g 4℃離心5分鐘后小心棄去乙醇；

S14、室溫干燥沉淀2～5分鐘，使酒精完全揮發(fā)后，用10-15μl DEPC-H2O溶解RNA，視沉淀量而定；

S2、反轉(zhuǎn)錄操作：

S21、用DNaseI處理RNA，10μl反應(yīng)體系包含：

DNaseI 1μl；

DNaseI buffer 1μl；

RNA 10μg；

DEPC-H2O up to 10μl；

輕輕混勻后瞬時(shí)離心，室溫放置15min后，加入1μl 25mM的EDTA，65℃處理10min，使DNaseI失活；

S22、在冰上于PCR管中加入以下試劑：

0.5μg/μl的oligo dTnV 1μl；

10mM/each的dNTPs 1μl；

去除DNA的RNA 5μg；

DEPC-H2Oupto 12μl；

輕輕混勻后，65℃處理5min后，迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻2min；

S23、在上述體系中加入：

5×RT buffer 4μl

0.1M DTT 2μl

RNase Inhibitor 1μl

37℃預(yù)熱2min，加入M-MLV RTase 1μl，37℃溫浴50min，70℃處理15min，使酶失活后，反應(yīng)產(chǎn)物加入40μl 1×TE稀釋，充分混勻，保存于-30℃?zhèn)溆茫?/p>

S3、以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，通過PCR方法擴(kuò)增獲得玉米CHB101基因，得克隆的CHB101基因；所述克隆的CHB101基因CDS序列全長為2349bp，編碼782個(gè)氨基酸組成的蛋白，編碼的蛋白帶有SWIRM和SANT保守結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)zinc-binding結(jié)構(gòu)域；

S4、玉米染色質(zhì)重塑蛋白基因CHB101的過表達(dá)載體構(gòu)建

在通用雙元載體pCAMBIA3301基礎(chǔ)上改造獲得的遺傳轉(zhuǎn)化載體；首先將序列表SEQ ID NO：4所示的玉米泛素基因啟動子通過SacI和BamHI酶切位點(diǎn)插入pCAMBIA3301中，得到改造遺傳轉(zhuǎn)化載體p3301-Ubi；對p3301-Ubi載體用限制性內(nèi)切酶SalI和NheI進(jìn)行酶切，去掉CaMV35S啟動子和GUS基因；將上述克隆所得的玉米CHB101基因用SalI和NheI消化并回收包含完成CHB101閱讀框的DNA片段，在把該片段連入上一步的酶切后p3301-Ubi載體，得到CHB101基因的過表達(dá)載體p3301-Ubi-CHB101；

S5、利用PDS-1000臺式基因槍進(jìn)行玉米幼胚轉(zhuǎn)基因操作，具體步驟如下：

1)材料選?。焊鶕?jù)授粉時(shí)間，取授粉后11天玉米H99種子的幼胚，此時(shí)玉米幼胚長約2mm；

2)沖洗玉米穗：加1滴Tween 20，在清水下浸泡、沖洗30min，然后用75％的乙醇泡30min，再用無菌水沖洗三遍；

3)預(yù)培養(yǎng)：將經(jīng)過2)處理后的幼胚，胚軸向下，盾面向上，放在鋪有濾紙的含有愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6E的培養(yǎng)皿中，30個(gè)幼胚/培養(yǎng)皿；纏好封口膜，置于培養(yǎng)箱，28℃，暗培養(yǎng)3天；得到預(yù)培養(yǎng)后幼胚；

4)高滲預(yù)培養(yǎng)：

將預(yù)培養(yǎng)后幼胚轉(zhuǎn)入含有N60SM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，28℃，暗培養(yǎng)，進(jìn)行高滲處理8h，得到高滲預(yù)培養(yǎng)后幼胚；

5)載體處理

在高滲處理期間，滅菌Holder和阻擋網(wǎng)，在金粉子彈中加入5μl已等摩爾比預(yù)混好的混合載體DNA，混勻，準(zhǔn)備好后放在冰上，得到包裹了質(zhì)粒的金粉懸液；

6)將所得的高滲預(yù)培養(yǎng)后幼胚放入基因槍，在載體膜上滴加步驟5)得到的包裹了質(zhì)粒的金粉懸液，基因槍真空度27～28psi，用650psi和1100psi可裂膜各轟擊一次，可裂膜至靶點(diǎn)距離：6cm/9cm；得到轟擊后幼胚；

7)將轟擊后幼胚在N6SOM培養(yǎng)基上28℃再次高滲預(yù)培養(yǎng)20h，采用暗培養(yǎng)，得到轟擊后高滲處理幼胚；

8)將轟擊后高滲處理幼胚轉(zhuǎn)移至無濾紙的N6E培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，篩選培養(yǎng)條件為28℃暗培養(yǎng)14天，得到篩選培養(yǎng)幼胚；

10)將篩選培養(yǎng)幼胚轉(zhuǎn)移至N6S培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)條件為28℃暗培養(yǎng)3周/次，共傳代3次，得到愈傷組織；

11)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基RMI上進(jìn)行分化培養(yǎng)，分化培養(yǎng)的條件為25℃，暗培養(yǎng)3周，得到生長出幼葉的成熟的體細(xì)胞胚；

12)將生長出幼葉的成熟的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至RMII培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)條件為25℃18h光6h光照培養(yǎng)15天，光照強(qiáng)度為4000lux，即可長出幼苗；

13)待幼苗長到3cm以上，根系完整時(shí)，將幼苗從RMII培養(yǎng)基移栽到盛有土的紙杯中，25℃，光培養(yǎng)，每天觀察土表面，待徹底干燥后澆水；當(dāng)紙杯中幼苗長到25cm高時(shí)即可移栽到大盆中，撕掉紙杯，將土和苗一移栽倒花盆或者實(shí)驗(yàn)田里，得到250株T0代轉(zhuǎn)基因玉米；將空載體pB7RWG采用同樣的方法轉(zhuǎn)入野生型玉米中，得到轉(zhuǎn)空載體玉米。