[發明專利]一種基于吖啶酮的β?葡萄糖醛酸苷酶的熒光探針及其應用

在審

• 申請號: 201711134306.6
• 申請日: 2017-11-16
• 公開（公告）號: CN107915764A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 馬驍馳;馮磊;田象閣;霍曉奎;王超;寧靜;于振龍;孫成鵬
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學
• 主分類號: C07H17/02
• 分類號: C07H17/02;C09K11/06;C12Q1/34;G01N21/64;G01N33/573
• 代理公司: 大連星海專利事務所有限公司21208
• 代理人: 楊翠翠

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的熒光探針及其應用。

背景技術

β-葡萄糖醛酸苷酶 (β-glucuronidase) 是一種糖苷水解酶，能將β-葡萄糖醛酸苷類化合物水解為相應的苷元和β-葡萄糖醛酸。目前，已在動物、植物以及微生物中發現β-葡萄糖醛酸苷酶的存在。人體中的β-葡萄糖醛酸苷酶是一種內源酶，由機體自身組織細胞產生、合成并分泌，目前已在各種組織和體液中分離得到，如巨噬細胞、血細胞、肝、脾、腎、腸、肺、肌肉、膽汁、腸液、尿以及血清等。在內臟器官細胞的溶酶體中，β-葡萄糖醛酸苷酶也有豐富的表達。作為糖蛋白定位于溶酶體的酸性水解酶，參與機體的生理、病理及藥物代謝過程，能維持機體正常的生理活動，主要負責溶酶體中多糖蛋白的降解，在降解皮膚素以及硫酸角質素過程中發揮重要作用。

近年的研究顯示， β-葡萄糖醛酸苷酶對疾病的診斷具有重要意義。首先，β-葡萄糖醛酸苷酶介導的水解反應，是維持機體代謝穩態的重要反應。β-葡萄糖醛酸苷酶與戊糖、葡萄糖醛酸酯、卟啉、淀粉以及蔗糖等多種代謝物的互變異構緊密相關，并在生理、病理情況下參與細胞外基質成分重塑，同時輔助維生素D、甲狀腺激素、膽紅素以及雌性激素等物質的肝腸循環。β-葡萄糖醛酸苷酶能夠促進體內潛在毒物、激素以及許多藥物的解離，并與多種重要的中間體代謝路徑相關，如參與抗壞血酸的生物合成。缺乏此酶會表現出 mucopoly saccharidosis type VII (MPS-VII) 或Slysyndrome 等癥狀。此外，它還能夠水解基底膜中的主要成分——蛋白多糖，直接參與細胞外基質的降解過程，從而在胃癌、乳腺癌等腫瘤的侵襲和轉移以及炎癥的發展過程中發揮重要作用。研究已經證明，腫瘤區域組織勻漿中的β-葡萄糖醛酸苷酶活性明顯高于周邊正常組織，而且結腸癌、肝癌、腎癌、膀胱癌等腫瘤患者的體液（血清、尿液、胃液、唾液）中β-葡萄糖醛酸苷酶活性顯著升高。考察β-葡萄糖醛酸苷酶活性能夠對這些癌癥的前期診療起到積極作用，因此，定量測定不同個體、器官組織以及其他各種生物樣品中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，對內外源性物質的代謝平衡、腫瘤的預測診斷具有重要價值。

由于β-葡萄糖醛酸苷酶的重要性，建立快速靈敏高效的檢測β-葡萄糖醛酸苷酶活性及功能的分析方法十分必要。在諸多的檢測方法中，比色法以及熒光法是最常見的檢測手段。目前，已報道的β-葡萄糖醛酸苷酶的熒光底物有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸脂、羥基喹啉-β-葡糖苷酸苷、對硝基苯酚基-β-葡萄糖酸苷、4-甲基傘形酮-β-葡糖苷酸等，分別利用吲哚、羥基喹啉、對硝基酚、4-甲基傘形酮等有色產物作為酶活檢測指標。然而基于小分子熒光探針檢測β-葡萄糖醛酸苷酶活性仍處于起步階段，最為常見的檢測β-葡萄糖醛酸苷酶活性的熒光探針為4-甲基傘形酮-β-葡萄糖醛酸苷，其激發、發生波長較短，易受背景熒光干擾。因此，在β-葡萄糖醛酸苷酶熒光探針開發上，仍存在很大的改進空間，選擇性高、干擾低的β-葡萄糖醛酸苷酶的特異性熒光探針底物的開發和應用，是目前臨床診斷、藥物開發與合理使用等領域厄待解決的科學問題。

發明內容

本發明提供一種基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的熒光探針及其應用，應用該特異性熒光探針作為底物，借助體外反應體系，經β-葡萄糖醛酸苷酶選擇性的水解，通過熒光檢測器定量測定熒光屬性明顯改變的水解產物，從而實現。利用該探針反應可對多種生物體系中β-葡萄糖醛酸苷酶的分布和功能進行定量評價，并可用于β-葡萄糖醛酸苷酶抑制劑的篩選。

本發明公開的β-葡萄糖醛酸苷酶的特異性熒光探針底物，分別為1,3-二氯-7- O-β-D-葡萄糖醛酸-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮（簡寫為DDAO-glu）。

DDAO-glu