[發(fā)明專利]酶膜耦合法制備均一分子量膠原蛋白多肽

在審

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• 申請日: 2017-11-16
• 公開（公告）號: CN109796528A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發(fā)明（設計）人: 南杰
• 申請（專利權(quán)）人: 南杰
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C07K1/16
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明描述了酶膜耦合法制備均一分子量膠原蛋白多肽。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。主要解決目前膠原蛋白酶法分解時對制品純度的干擾問題，克服傳統(tǒng)膠原肽段由于酶解造成對測試結(jié)果干擾或?qū)ι锊牧现苽浼兓挠绊憽?/p>

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶膜耦合法制備均一分子量膠原蛋白多肽，制備的肽段可用于膠原分型、電泳和架橋分析，也可用于生物材料的制備。

背景技術(shù)

無論是在膠原蛋白一級結(jié)構(gòu)分析中，還是在膠原類生物材料的制備中，由于反應定量性的限制或材料性質(zhì)的特殊要求，常需要對膠原蛋白進行切斷處理，傳統(tǒng)方法一般是利用胰蛋白酶、胃蛋白酶等酶解切斷，但由于酶也是一種特殊的蛋白質(zhì)，其作用完成后的殘留即成為制品中的雜質(zhì)，對后期的分析和使用都會帶來干擾和純化的困難。本發(fā)明則利用CNBr與蛋白質(zhì)中蛋氨酸殘基反應，生成含有甲基硫氰酸和帶有高絲氨酸內(nèi)酯的肽段(位于C末端)，以及結(jié)合在蛋氨酸殘基C段的氨基酸殘基(成為新的N末端)形成的肽段。而副產(chǎn)物主要包括甲基硫氰酸、溴化氫和過量的CNBr，這些副產(chǎn)物極易揮發(fā)，通過簡單的凍干處理即可除去。這樣形成的肽段有利于后期分析測試和材料制備。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種酶膜耦合法制備均一分子量膠原蛋白多肽。其步驟如下：

1、取市售或自制膠原溶于1～50ml的50～80％(v/v)乙酸溶液中，通氨氣5～20min除氧；

2、加入CNBr固體10～80mg或濃度為90～99％(w/v)CNBr的乙酸溶液(所用乙酸濃度與上步驟一致)10～150ml，再次通氨氣1～5min；

3、密封容器中攪拌反應2～40小時，控制反應溫度為4～35℃，反應后，加入2～15倍的去離子水稀釋并凍干；

4、凍干樣品再加2～15倍的去離子水稀釋并凍干，可如此反復多次，直至過量反應物和副產(chǎn)物脫除干凈；

5、將冷凍干燥樣品10～100mg溶解于2～200ml起始緩沖液中，30～50℃條件下加熱處理8～20min后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫；

6、以226nm測定樣品吸光度，分別收集峰I、峰II、峰III，凍干即為三個肽段。

具體實施方式

實施例一

取10mg市售或自制膠原溶于20ml的70％(v/v)乙酸溶液中，通氨氣10min除氧。加入CNBr固體40mg，再次通氨氣2min。密封容器中攪拌反應4小時，控制反應溫度為30℃，反應完成后，加入8倍的去離子水稀釋并凍干。凍干樣品再加5倍的去離子水稀釋并凍干，如此反復2次。使用市售翔丙基甲基纖維素層析填料。起始緩沖液為0.02mol/L檸檬酸鈉(PH3.6)緩沖液。洗脫緩沖液為0.18mol/L檸檬酸鈉(PH3.6)緩沖液。柱清洗緩沖液為0.01mol/L NaOH緩沖液。填柱溫度為45℃，填柱緩沖液為柱清洗緩沖液，柱平衡用起始緩沖液進行，直至PH值達到3.6。將冷凍干燥樣品10mg溶解于2ml起始緩沖液中，50℃條件下加熱處理10min后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫。以226nm測定樣品吸光度，分別收集峰I、峰II、峰III，凍干即為三個肽段。

實施例二

取10mg市售或自制膠原溶于50ml的50％(v/v)乙酸溶液中，通氨氣15min除氧。加入CNBr固體70mg，再次通氨氣5min。密封容器中攪拌反應8小時，控制反應溫度為10℃，反應完成后，加入10倍的去離子水稀釋并凍干。凍干樣品再加8倍的去離子水稀釋并凍干，如此反復2次。使用市售纖維素乙醇層析填料。起始緩沖液為0.05mol/L檸檬酸鈉(PH2.2)緩沖液。洗脫緩沖液為0.23mol/L檸檬酸鈉(PH2.2)緩沖液。柱清洗緩沖液為0.1mol/L NaOH緩沖液。填柱溫度為35℃，填柱緩沖液為柱清洗緩沖液，柱平衡用起始緩沖液進行，直至PH值達到2.2。將冷凍干燥樣品10mg溶解于5ml起始緩沖液中，35℃條件下加熱處理8min后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫。以226nm測定樣品吸光度，分別收集峰I、峰II、峰III，凍干即為三個肽段。