[發明專利]一種鱘魚精蛋白及鱘魚精蛋白多肽的制備方法

有效

• 申請號: 201711131728.8
• 申請日: 2017-11-15
• 公開（公告）號: CN107857806B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 白嬋;廖濤;熊光權;耿勝榮;饒丹華;鉏曉艷;張金木;李海藍;李新;汪蘭;吳文錦
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所;廣州輻銳高能技術有限公司
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/16;C12P21/06
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 朱盛華

1.一種鱘魚精蛋白多肽的制備方法，其特征在于：具體步驟如下：

1）取除雜處理后的鱘魚白切碎成漿狀，加0.14 mol/L NaCl，0.05 mol/L NaEDTA和0.001 mol/L PMSF的混合溶液，均質勻漿攪拌1 min，于0℃攪拌20 min，靜置10 min，0℃低溫離心，棄去上清液，重復3次，得沉淀物；

2）取步驟1）所得沉淀物按體積比1：6加入濃度為0.8 mol/L的硫酸溶液，溫度35℃，提取30 min， 在0℃低溫離心10 min，過濾，取濾液后的濾渣再重復用上述濃度的硫酸溶液提取4次，合并濾液；

3）取步驟2）所得濾液用NaOH調節pH至7.0，透析除鹽后用其體積三倍的95%冷乙醇沉淀，沉淀物分別用丙酮和乙醚各洗2次，真空冷凍干燥24 h，得鱘魚粗蛋白；

所述真空冷凍干燥條件為溫度-50℃，壓力10 Pa；

4）將步驟3）所得鱘魚粗蛋白經過兩步純化，得鱘魚精蛋白；

所述兩步純化為Sephadex G-50葡聚糖凝膠層析和CM Sepharose Fast Flow離子交換層析純化；

每步分離純化前都加入0. 5 mol/L NaEDTA和0. 1 mol/L PMSF的混合溶液；

步驟4）所得鱘魚精蛋白，分子量為10.8ku，賴氨酸、組氨酸和精氨酸三種堿性氨基酸含量達57.4%，占氨基酸總量的81.1%；所述鱘魚精蛋白結構中主要為無規則卷曲結構，無規則卷曲構象占64.70%，α-螺旋占7.05%，β-折疊15.55%，β-轉角15.55%；所述鱘魚精蛋白具有高結合水能力，其吸水率達88.8±0.13%，持水力達75.7±0.08%；

鱘魚精蛋白相變溫度可達92.5℃；

5）將步驟4）所得鱘魚精蛋白以體積比1:30加入pH為7的磷酸鹽緩沖液勻漿，得鱘魚精蛋白溶液；

6）將步驟5）所得鱘魚精蛋白溶液移入透明玻璃杯并向其中加入其體積3%的木瓜蛋白酶，然后置于⁶⁰Co輻照場中通過γ射線輻照，取出后在60℃水浴中加熱酶解8 h，得酶解液；

所述⁶⁰Co輻照場中通過γ射線輻照的輻照方法為：透明玻璃杯距地面高40 cm，距離⁶⁰Co輻照源1.4 m，輻照劑量率為33 Gy/min，輻照時間120 min，輻照不均勻度小于1.0，輻照環境溫度18℃；

7）取步驟6）所得酶解液，沸水滅酶10 min，冷卻；加入與酶解液等體積的，百分濃度為20%的三氯乙酸溶液，于0℃下離心15 min，取上清液，真空冷凍干燥24 h，即得鱘魚精蛋白多肽；

所述真空冷凍干燥條件溫度-50℃，壓力10 Pa；

步驟7）所得鱘魚精蛋白多肽含有分子量為1.6ku，3.4ku和9.3ku的三種多肽組分；所得鱘魚精蛋白多肽吸水率達106.0±0.09%，持水率為81.3±0.05%；

所述鱘魚精蛋白多肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌和黃曲霉均有抑制作用；

所述鱘魚精蛋白多肽清除超氧陰離子自由基活性為：分子量為1.6ku的鱘魚精蛋白多肽的O₂^-?清除活性的IC₅₀值為0.9 mg/mL，分子量為3.4ku的鱘魚精蛋白多肽的O₂^-?清除活性的IC₅₀值為3.5 mg/mL，分子量為9.3ku的鱘魚精蛋白多肽的O₂^-?清除活性的IC₅₀值為16.43mg/mL。

2.根據權利要求1所述的一種鱘魚精蛋白多肽的制備方法，其特征在于：步驟4）中的Sephadex G-50葡萄糖凝膠層析條件為：紫外檢測波長220 nm，恒流泵流速480 mL/h，上樣3~4 mL，每3 min收集1試管，將收集到的紫外吸收峰內的溶液合并，旋蒸濃縮；CM SepharoseFast Flow離子交換層析的條件為：紫外檢測波長為220 nm，將上一步純化的有效組分，每次以4~6 mL的量上樣，1 mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，每3 min收集1試管，最后合并有效組分，鑒定后乙醇沉淀分離，于-50℃，壓力10 Pa下冷凍干燥24 h，得精魚精蛋白。