[發明專利]轉氨酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201711131103.1
• 申請日: 2017-11-15
• 公開（公告）號: CN108048419B
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 洪浩;詹姆斯·蓋吉;盧江平;徐幸福;于文燕;黃鑫;馬玉磊;程逸冰
• 申請（專利權）人: 凱萊英生命科學技術(天津)有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12P17/10
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 韓建偉;謝湘寧

本發明公開了一種轉氨酶突變體及其應用。該轉氨酶突變體的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示氨基酸序列發生突變的氨基酸序列，突變的氨基酸位點選自F89、K193、P243、V234、I262、Q280、V379、R416、A417及C418中的一個或多個。具有上述至少一個突變位點的轉氨酶突變體，其酶活性和/或穩定性大大提高。

技術領域

本發明涉及酶工程領域，具體而言，涉及一種轉氨酶突變體及其應用。

背景技術

酶作為生物催化劑，在生物體內能充分發揮其高效和高特異性的特點。但是在工業應用中，卻普遍存在無法適應工業生產條件以及對非天然底物的催化能力低等問題。定點突變和飽和突變技術是酶分子進行改造的有效手段。

定點突變(site-directed mutagenesis或site-specific mutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位點上引入特定的堿基對的方法。通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，常用于研究某個(些)氨基酸殘基對蛋白質結構和功能的影響。在酶的理性設計中，采用定點突變方法可篩選得到催化活性、底物特異性和/或穩定性提高的突變酶。

飽和突變是通過對目的蛋白的編碼基因進行改造，短時間內獲取靶位點氨基酸分別被其它19種氨基酸替代的突變體的一種方法。此方法不僅是蛋白質定向改造的強有力工具，而且是蛋白質結構－功能關系研究的重要手段。飽和突變往往能獲得比單點突變更為理想的進化體。而對于定點突變方法不能解決的這些問題，恰恰是飽和突變方法所擅長的獨特之處。

ω－轉氨酶(ω－TA)屬于轉移酶類，同其他的轉氨酶類一樣，催化一個氨基與酮基互換的過程。ω－轉氨酶以酮類化合物為原料，通過立體選擇性地轉氨基作用，可以高效生產手性胺，受到眾多研究人員關注和重視。

3-氨基吡咯烷衍生物及其光學異構體是一種手性胺化合物，是合成大量手性藥物或農業化學品的關鍵中間體。(S)-1-芐氧羰基-3-氨基吡咯烷是重要的具有光學活性的3-氨基吡咯烷衍生物。J.M.C1992,35,1764報道的以(R)-1-芐基-3-吡咯烷醇為起始原料，用五步反應制得(S)-1-芐氧羰基-3-氨基吡咯烷，其ee值為96％，合成路線如下：

該合成路線的起始原料價格較高，且合成工藝中使用了有害試劑疊氮化鈉，對操作設備及人員安全、三廢處理等要求較高，對環境的污染較大。但目前報道的利用生物酶生物催化不對稱合成手性(S)-1-芐氧羰基-3-氨基吡咯烷的方法極少。

盡管目前也有報道，轉氨酶可以作為生物催化劑，一步還原酮底物，制備高光學純度的(S)-1-芐氧羰基-3-氨基吡咯烷。與傳統化學方法相比，生物轉化法的反應條件溫和，避免了強氧化劑、強還原劑以及危險試劑的使用，條件溫和，對環境污染小。

但是該生物轉化法在工業生產的應用中，依然存在一些問題需要進一步解決，該方法中酶催化活性不夠高效，其反應體系總體積為40-60ml/g底物，反應體系體積大，導致了生產批次和生產成本的增加，并且導致后處理過程中有機溶劑的用量大，會增加反應后處理的難度，給環境帶來較大的負擔。另外現有技術中多數以D-丙氨酸或L-丙氨酸或其鹽做為氨基供體，在反應體系中還需要加入葡萄糖和GDH，甲酸銨和FDH等偶聯輔酶體系。

因此，仍需要對現有的生物轉化法進行改進，以提高轉氨酶的催化特性，減少反應體系總體積，降低生產成本，減少環境污染。

發明內容

本發明旨在提供一種轉氨酶突變體及其應用，以提高其催化活性。

為了實現上述目的，根據本申請的一個方面，提供了一種轉氨酶突變體，轉氨酶突變體的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示序列發生突變的氨基酸序列，突變的氨基酸位點選自F89、K193、P243、V234、I262、Q280、V379、R416、A417及C418中的一個或多個。