[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711130808.1
• 申請(qǐng)日: 2017-11-15
• 公開（公告）號(hào): CN107841473A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龔愛華;朱沛煌;嚴(yán)永敏;曾建;彭琬昕;杜鳳移;崔恒林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N9/56;A23L11/00;A23P10/28;A23L33/10;C12R1/125
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高產(chǎn)納豆激酶的枯草芽抱桿菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

截止到2016年，我國60歲以上老年人口為2.2億人，占總?cè)丝诘?6.1％，中國已進(jìn)入老齡化社會(huì)。血栓性疾病是中老年人群的高發(fā)病，是現(xiàn)今僅次于癌癥的第二大病癥，具有很高的死亡威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前全球每年有約1700萬人死于心臟病和其他心腦血管疾病，占全球死亡人數(shù)的三分之一。目前，溶解血栓是治療這一類疾病的重要手段，當(dāng)今用于臨床治療的藥物包括鏈激酶、尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑、單鏈尿激酶型血纖溶酶原活劑、化學(xué)修飾的血纖溶酶一鏈激酶激活劑復(fù)合物等，但是這些藥物都存在明顯不足：全身性出血副作用、藥物半衰期短、價(jià)格昂貴等，因此，開發(fā)新型溶血栓藥物已成為當(dāng)前重要研究課題之一。

納豆激酶(Nattokinase，NK)是一種枯草桿菌蛋白激酶，是在納豆發(fā)酵過程中由納豆枯草桿菌產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，具有溶解血栓、降低血粘度，改善血液循環(huán)，軟化和增加血管彈性等作用。納豆激酶對(duì)纖溶蛋白原不敏感，但可直接水解交聯(lián)纖維蛋白，將其轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄晕镔|(zhì)，達(dá)到溶栓目的。此外納豆激酶可以間接促進(jìn)組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)的生成，并可以激活體內(nèi)的纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖溶酶而作用于纖維蛋白，所以納豆激酶具有直接溶解纖維蛋白及通過調(diào)節(jié)和尿激酶間接溶解纖維的功能。

納豆激酶作為新一代溶栓藥物具有藥理作用直接且多元化、體內(nèi)半衰期長、分子量相對(duì)較小可直接通過胃腸系統(tǒng)被人體吸收、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。并且納豆激酶只溶解血栓的主體物質(zhì)纖維蛋白，不水解血漿纖維蛋白原，所以不會(huì)引發(fā)出血的危險(xiǎn)，同時(shí)，還能激活增強(qiáng)人體自身的溶栓能力，從而起到持久平穩(wěn)的溶栓作用。然而目前國內(nèi)的納豆激酶產(chǎn)品活性普遍比較低，篩選具有高活力納豆激酶生產(chǎn)能力的菌株，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌亞種Bacillus subtilis subsp.UJS-11，該菌株具備高產(chǎn)納豆激酶的特征，將該菌株應(yīng)用于納豆激酶的液態(tài)發(fā)酵，提高了發(fā)酵液中納豆激酶含量，以解決納豆激酶大規(guī)模工業(yè)液態(tài)發(fā)酵缺乏優(yōu)良菌種，納豆激酶生產(chǎn)成本高的實(shí)際問題。該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。保藏編號(hào)：CGMCC No.14435，保藏時(shí)間：2017年07月17日。建議的分類命名：枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis.

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供一種枯草芽孢桿菌亞種Bacillus subtilis subsp.UJS-11在制備納豆激酶預(yù)防心腦血栓疾病保健品與食品中的應(yīng)用。

一種利用枯草芽孢桿菌亞種Bacillus subtilis subsp.UJS-11制備納豆激酶發(fā)酵液與提純品中的方法，按照下述步驟進(jìn)行：

1)含有納豆激酶發(fā)酵液的制備：

將枯草芽孢桿菌亞種Bacillus subtilis subsp.UJS-11菌株接種到LB平板培養(yǎng)基上37℃活化24小時(shí)，接種到種子液二次活化后按5％的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200rpm條件下發(fā)酵48h，取發(fā)酵液離心，利用瓊脂糖——纖維蛋白平板法測(cè)得發(fā)酵上清液酶活為35850u/ml。

2)納豆激酶的提純：

將發(fā)酵液在4℃，10000rpm，20min條件下離心，收集發(fā)酵上清。向上清液中分多次加入硫酸銨粉末，達(dá)到30％飽和度。4℃低速顛倒混合鹽析6小時(shí)，4℃，10000rpm，20min條件下離心，收集上清液。向上清液中分多次加入硫酸銨粉末，達(dá)到75％飽和度。4℃低速顛倒混合鹽析6小時(shí)，4℃，10000rpm，20min條件下離心，收集沉淀。用適量PH7.2的PBS緩沖液溶解沉淀，-80℃冷凍，送凍干機(jī)凍干，收集凍干粉即為高純度的納豆激酶粉，利用瓊脂糖——纖維蛋白平板法測(cè)得高純納豆激酶粉酶活為594730u/g。

一種可預(yù)防心腦血栓疾病的納豆激酶保健品的的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行：

1)按質(zhì)量百分比，將干燥后含水量在4-6％的上述過程制備的高純納豆激酶粉5％，納豆凍干粉35％，維生素C 10％，乳酸鈣10％，枸杞提取物5％，百合提取物5％，麥芽糊精26％在混料機(jī)混合均勻。

2)經(jīng)過公知方法的造粒，干燥后加入4％的硬脂酸鎂，混合均勻后，送入壓片機(jī)壓片，每片500mg。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：