[發(fā)明專利]一種觀察植物細胞膜上蛋白同源二聚體分布情況的方法

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• 申請日: 2017-11-15
• 公開（公告）號: CN107881192A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發(fā)明（設計）人: 林金星;李瑞麗;玉猛
• 申請（專利權）人: 北京林業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/12;A01H6/82;A01H6/20
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,張立娜

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種觀察植物細胞膜上蛋白同源二聚體分布情況的方法。

背景技術

細胞膜上蛋白之間可以相互作用形成寡聚體，這種寡聚化狀態(tài)對維持細胞信號轉導具有十分重要的作用。其中，同源二聚體尤為重要。因此，對細胞膜上存在的同源二聚體分布的觀察十分必要。全內反射熒光顯微術(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy,TIRFM)在觀察細胞膜蛋白分布和運動中有著重要的地位，這種技術只激發(fā)距細胞膜表面100-300nm范圍內的熒光基團，從而排除了其他熒光信號可能產生的干擾，增強了熒光顯微鏡在Z軸的分辨率。基于這一技術，科學家發(fā)明了全內反射熒光顯微鏡。已有研究報道了TIRFM可以觀察細胞膜上單個蛋白質的分布。但是尚未有報道應用該技術觀察植物細胞膜上同源二聚體蛋白的分布情況，原因在于植物含有細胞壁并且標記同源二聚體困難等種種原因。

部分熒光蛋白可以分成兩段，這兩段分別與兩個蛋白相連形成融合蛋白，當連接的兩個蛋白相互作用時，熒光蛋白的兩段相互靠近，恢復熒光活性，從而發(fā)光。這一技術即雙分子熒光互補技術(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種觀察植物細胞膜上蛋白同源二聚體分布情況的方法。

本發(fā)明所提供的觀察植物細胞膜上蛋白同源二聚體分布情況的方法，可包括如下步驟：

(a)將目的蛋白的編碼基因分別克隆到成對的BiFC表達載體中，得到兩個重組表達載體；所述目的蛋白為能夠在植物細胞膜上形成同源二聚體的任何蛋白；

(b)將所述兩個重組表達載體導入到受體植物的葉片中；

(c)利用TIRFM顯微鏡對所述受體植物的葉片進行觀察。

進一步地，步驟(a)中，所述成對的BiFC表達載體為成對的BiFC植物雙元表達載體。其中，一個攜帶熒光蛋白的N端的編碼基因，另一個攜帶所述熒光蛋白的C端的編碼基因。所述熒光蛋白的N端的編碼基因和所述熒光蛋白的C端的編碼基因分別與所述目的蛋白的編碼基因融合成兩個融合基因；當兩個融合基因所表達出的兩個融合蛋白相互作用(即目的蛋白能夠形成同源二聚體)時，熒光蛋白的兩段相互靠近，恢復熒光活性，從而發(fā)光。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述熒光蛋白具體為YFP，啟動子為CaMV 35S啟動子，終止子為NOS終止子。更加具體的，所述成對的BiFC表達載體為pNYE和pCYE。

進一步地，步驟(b)中，所述“將所述兩個重組表達載體導入受體植物的葉片”可按照包括如下步驟的方法實現(xiàn)：

(b1)將所述兩個重組表達載體分別轉化至農桿菌感受態(tài)細胞中，得到兩種重組農桿菌；

(b2)向所述兩種重組農桿菌中分別加入農桿菌侵染緩沖液，調節(jié)OD₆₀₀為0.1～0.3，得到兩種侵染菌液；

(b3)將所述兩種侵染菌液等體積混合，用無針頭注射器(規(guī)格可為1ml)吸取后抵住所述受體植物葉片背面進行注射，從而實現(xiàn)將所述兩種重組表達載體導入所述受體植物的葉片。

更進一步地，在步驟(b1)中，所述兩個重組表達載體可通過熱激法或者電擊法轉化至所述農桿菌感受態(tài)細胞中。

更進一步地，在步驟(b1)中，將所述兩個重組表達載體分別轉化至所述農桿菌感受態(tài)細胞中后還包括應用PCR技術篩選陽性克隆農桿菌，并培養(yǎng)至農桿菌生長對數期后收集農桿菌的步驟。

更加具體的，所述農桿菌感受態(tài)細胞可為GV3101、LBA44044、EHA105或AGL1。進行所述培養(yǎng)時所用的農桿菌培養(yǎng)液具體可為LB培養(yǎng)液(配方：酵母提取物5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl 10g/L；pH 7.0)。

更進一步地，在步驟(b2)中，所述農桿菌侵染緩沖液的溶劑為水，溶質及濃度為：0.5g/100ml D-葡萄糖，50mM MES，2mM Na₃PO₄·12H₂O，pH 5.4。

進一步地，在步驟(b)中，將所述兩個重組表達載體導入所述受體植物的葉片后，還可包括對所述受體植物培養(yǎng)24-36小時的步驟。具體的培養(yǎng)條件可為16小時光照/8小時黑暗，22℃恒溫。