[發明專利]一種觀察植物細胞膜上蛋白同源二聚體分布情況的方法在審
| 申請號： | 201711129425.2 | 申請日： | 2017-11-15 |
| 公開（公告）號： | CN107881192A | 公開（公告）日： | 2018-04-06 |
| 發明（設計）人： | 林金星;李瑞麗;玉猛 | 申請（專利權）人： | 北京林業大學 |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;A01H5/12;A01H6/82;A01H6/20 |
| 代理公司： | 北京紀凱知識產權代理有限公司11245 | 代理人： | 關暢,張立娜 |
| 地址： | 100083 *** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 觀察 植物 細胞膜 蛋白 同源 二聚體 分布 情況 方法 | ||
1.一種觀察植物細胞膜上蛋白同源二聚體分布情況的方法，包括如下步驟：
(a)將目的蛋白的編碼基因分別克隆到成對的BiFC表達載體中，得到兩個重組表達載體；所述目的蛋白為能夠在植物細胞膜上形成同源二聚體的任何蛋白；
(b)將所述兩個重組表達載體導入到受體植物的葉片中；
(c)利用TIRFM顯微鏡對所述受體植物的葉片進行觀察。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(a)中，所述成對的BiFC表達載體為成對的BiFC植物雙元表達載體。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟(b)中，所述“將所述兩個重組表達載體導入受體植物的葉片”是按照包括如下步驟的方法進行的：
(b1)將所述兩個重組表達載體分別轉化至農桿菌感受態細胞中，得到兩種重組農桿菌；
(b2)向所述兩種重組農桿菌中分別加入農桿菌侵染緩沖液，調節OD600為0.1～0.3，得到兩種侵染菌液；
(b3)將所述兩種侵染菌液等體積混合，用無針頭注射器吸取后抵住所述受體植物葉片背面進行注射，從而實現將所述兩種重組表達載體導入所述受體植物的葉片。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：在步驟(b1)中，所述兩個重組表達載體是通過熱激法或者電擊法轉化至所述農桿菌感受態細胞中的；和/或
在步驟(b1)中，將所述兩個重組表達載體分別轉化至所述農桿菌感受態細胞中后還包括應用PCR技術篩選陽性克隆農桿菌，并培養至農桿菌生長對數期后收集農桿菌的步驟。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述農桿菌感受態細胞為GV3101、LBA44044、EHA105或AGL1；和/或
進行所述培養時所用的農桿菌培養液為LB培養液。
6.根據權利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：在步驟(b2)中，所述農桿菌侵染緩沖液的溶劑為水，溶質及濃度為：5g/L D-葡萄糖，50mM MES，2mM Na3PO4·12H2O，pH 5.4。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：在步驟(b)中，將所述兩個重組表達載體導入所述受體植物的葉片后，還包括對所述受體植物培養24-36小時的步驟。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：步驟(c)中，所述“利用TIRFM顯微鏡對所述受體植物的葉片進行觀察”是按照包括如下步驟的方法進行的：用剪刀在注射器浸染孔處剪取0.5-1cm2的所述受體植物的葉片，制片，樣片放置于TIRFM顯微鏡上，并調節至激發光呈全內反射條件，之后進行觀察。
9.根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述受體植物為雙子葉植物或單子葉植物。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于：所述雙子葉植物為煙草或擬南芥。
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