[發(fā)明專利]一種富含綠原酸類物質(zhì)金銀花細(xì)胞的生產(chǎn)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711128849.7
• 申請(qǐng)日: 2017-11-15
• 公開（公告）號(hào): CN109757372A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 熊建華;李冬梅;杜娟;杜華英;胡昭君;羅秋水
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11305
• 代理人: 呂世靜

1.一種富含綠原酸類物質(zhì)金銀花細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法的步驟如下：

A、預(yù)處理

金銀花嫩芽先用清水沖洗，再放到洗衣粉溶液中浸泡，接著用清水沖洗干凈，晾干；

B、消毒

步驟A得到的晾干金銀花嫩芽在酒精溶液中進(jìn)行消毒處理，接著在次氯酸鈉水溶液中進(jìn)行消毒處理；

消毒處理的金銀花嫩芽用無(wú)菌水沖洗3～5次，接著置于無(wú)菌濾紙上吸干水分，再在無(wú)菌條件下將金銀花嫩芽切成尺寸為0.4～0.6cm的切傷金銀花嫩芽段；

C、配制培養(yǎng)基

(i)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基

稱取4.74gMS培養(yǎng)基粉、7g瓊脂與30g蔗糖，加水溶解脹，在微波功率800W下加熱6min使其溶解，制成1LMS固體培養(yǎng)基，再加入NAA、KT、2,4-D與6-BA植物激素，使它們的濃度分別達(dá)到1.5mg/LNAA、0.75mg/LKT、1.0mg/L2,4-D與0.15mg/L6-BA，混合均勻，得到的溶液再使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液將其pH值調(diào)節(jié)至5.8，然后按照50mL/瓶分裝于培養(yǎng)瓶中，置于滅菌鍋中滅菌，接著冷卻至室溫，得到所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

(ii)繼代培養(yǎng)基

稱取4.74g MS培養(yǎng)基粉、7g瓊脂與30g蔗糖，加水溶解制成1L MS固體培養(yǎng)基，再加入6-BA、NAA與2,4-D植物激素，使它們的濃度分別達(dá)到1.5mg/L 6-BA、0.2mg/LNAA與0.1mg/L 2,4-D，混合均勻，得到的溶液再使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液將其pH值調(diào)節(jié)至5.8，然后按照50mL/瓶分裝于培養(yǎng)瓶中，置于滅菌鍋中滅菌，接著冷卻至室溫，得到所述的繼代培養(yǎng)基。

(iii)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基

往4.74g/L液體MS培養(yǎng)基中加入6-BA、NAA、2,4-D植物激素與蔗糖，使它們的濃度分別達(dá)到1.4mg/L 6-BA、0.5mg/LNAA、0.7mg/L 2,4-D以及30g/L蔗糖，混合均勻，得到的溶液再使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液將其pH值調(diào)節(jié)至5.8，然后置于滅菌鍋中滅菌，接著冷卻至室溫，得到所述的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基。

D、愈傷組織

在無(wú)菌的條件下，把步驟B的切傷金銀花嫩芽段接種到步驟C(i)制備的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在人工智能氣候箱中暗培養(yǎng)9天，接著在有光與黑暗的條件下交替培養(yǎng)，其中每天在光照2000lux下培養(yǎng)14h，在培養(yǎng)6～8天后，金銀花嫩芽在傷口處長(zhǎng)出愈傷組織，20～24天愈傷組織生長(zhǎng)量達(dá)到高峰，此時(shí)在無(wú)菌條件下取出愈傷組織；

E、繼代培養(yǎng)

在無(wú)菌的條件下，把步驟D取出的愈傷組織接種到步驟C(ii)制備的繼代培養(yǎng)基中，放置于人工氣候箱中進(jìn)行光、暗交替培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000lx，光照時(shí)間為14h·d^-1，培養(yǎng)20～24天，得到生長(zhǎng)良好的愈傷組織；

F、金銀花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系建立

在無(wú)菌的條件下，用鑷子將步驟E生長(zhǎng)良好的愈傷組織夾碎；按照接種量0.2g/mL，把夾碎的愈傷組織接種到步驟C(iii)制備的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)6～8天，得到主要以2～10個(gè)細(xì)胞團(tuán)形式與少數(shù)為單細(xì)胞存在的金銀花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系

G、后處理

讓細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，從第5天細(xì)胞數(shù)量急劇增加時(shí)加入茉莉酸甲酯與水楊酸，使該體系的茉莉酸甲酯濃度達(dá)到200μmol/L、水楊酸濃度達(dá)到50μmol/L，同時(shí)使用紫外燈在紫外強(qiáng)度133lx下照射2h·d^-1，接著再在同樣條件下培養(yǎng)6～8天，得到252～261g/L金銀花細(xì)胞的培養(yǎng)液，過濾，用蒸餾水洗凈，瀝盡水分，將富含綠原酸類物質(zhì)的金銀花細(xì)胞烘干，得到質(zhì)量濃度為20.1～20.8g/L的富含綠原酸類物質(zhì)的金銀花細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于在步驟A中，金銀花嫩芽用清水沖洗4～6次，然后在濃度為以重量計(jì)1.5～2.5％的洗衣粉溶液中浸泡15～20min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于在步驟A中，晾干金銀花嫩芽在濃度為以體積計(jì)65～75％酒精溶液中消毒處理25～30s，再在濃度為以重量計(jì)4～6％的次氯酸鈉水溶液中消毒處理8～12min。