[發(fā)明專利]一種沉默表達(dá)WSB2蛋白的慢病毒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711126521.1
• 申請日: 2017-11-15
• 公開（公告）號: CN109777787A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋鑫;張一;李真;孟旭東
• 申請（專利權(quán)）人: 信雅生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N5/10;C12N15/867;C12N15/113;A61K31/713;A61P35/00
• 代理公司: 上海宣宜專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31288
• 代理人: 劉君

本發(fā)明的目的是提供一種在人黑色素瘤細(xì)胞中沉默表達(dá)WSB2蛋白的慢病毒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。采用本發(fā)明的方法構(gòu)建的慢病毒LV?shWSB2具有使WSB2基因沉默效果，且能低表達(dá)WSB2蛋白，低表達(dá)WSB2蛋白能夠抑制人黑色素瘤細(xì)胞A375的增殖。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種在人黑色素瘤細(xì)胞中沉默表達(dá)WSB2蛋白的慢病毒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

黑色素瘤(melanoma)惡性程度高，對放化療均不敏感。全球發(fā)病率及死亡率逐年上升，且呈年輕化趨勢，提示其原因可能與某些內(nèi)在致病基因相關(guān)并發(fā)揮重要作用。令人遺憾的是：黑色素瘤發(fā)病機(jī)理長期未獲得突破性進(jìn)展。因此，深入開展針對性的基因篩查研究有望為黑色素瘤防治提供新的干預(yù)策略。

最新研究表明，WSB2(WD repeat and SOCS box containing 2)蛋白分子量為45.3KDa，定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，是WD重復(fù)蛋白(wd-repeat protein)亞家族的成員。其蛋白結(jié)構(gòu)中含5個(gè)WD重復(fù)序列和在C末端的SOCS框(Suppressor of cytokine signalingbox)。WD重復(fù)蛋白直接與泛素連接酶E3(E3Ubiquitin Ligases)結(jié)合，SOCS框與泛素化底物結(jié)合，充當(dāng)E3酶與泛素化底物結(jié)合的橋梁。由于特殊蛋白結(jié)構(gòu)，WSB2蛋白具有泛素連接酶的作用，可能與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。目前為止，尚無一種在黑色素瘤組織中特異性高表達(dá)的基因，因此探尋新的黑色素瘤組織相對特異高表達(dá)的基因，從分子、細(xì)胞、動物、臨床組織四個(gè)方面闡明其在黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展變化中的復(fù)雜分子調(diào)控作用機(jī)理及其有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與機(jī)制，不僅有重要的分子/細(xì)胞生物學(xué)意義，而且對黑色素瘤的早期基因診斷及精準(zhǔn)治療，均具有重大臨床應(yīng)用價(jià)值和社會效應(yīng)，有望取得新的突破。

因此，為診斷和治療目的，研究和開發(fā)在黑色素瘤中高表達(dá)的基因和/或蛋白具有重大理論和現(xiàn)實(shí)意義。本領(lǐng)域迫切需要研究新的黑色素瘤組織高表達(dá)基因和/或蛋白，目前尚無WSB2在黑色素瘤中的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及構(gòu)建在人黑色素瘤細(xì)胞中沉默表達(dá)WSB2蛋白的慢病毒，其特征在于：包含特異性靶向序列1“CTTCGAAGTTTCCTAACAA”、序列2“CGGCTTCTTACGATACCAA”、序列3“AGACACTATTACTGGCTTT”，可用于特異性沉默WSB2基因表達(dá)。

另外，本發(fā)明還涉及構(gòu)建在人黑色素瘤細(xì)胞中沉默表達(dá)WSB2蛋白的慢病毒的方法，其包括如下步驟：

一、慢病毒LV-WSB2的構(gòu)建。

1.利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)數(shù)據(jù)庫，獲得人WSB2基因的編碼(CDS)區(qū)序列：