[發(fā)明專利]檢測飲用水中四種致病菌的四重?zé)晒釶CR引物組、探針組、試劑盒及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711126058.0
• 申請日: 2017-11-15
• 公開（公告）號: CN108004334B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫端方;羅紹楠;左澤彥;董睿;李春宇;田志強;張謙;黃家瑞
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州瑞之凡知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44514
• 代理人: 黃愛君

本發(fā)明公開了檢測飲用水中四種致病菌的四重?zé)晒釶CR引物組，包括針對大腸菌群、糞鏈球菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的引物，具體如Seq.ID No.1至Seq.ID No.8所示。本發(fā)明屬于基因工程檢測技術(shù)領(lǐng)域，各引物和探針不會造成相互干擾，僅能對特定目標(biāo)序列進行擴增并激發(fā)熒光信號，對非目標(biāo)序列無擴增和熒光信號，可以實現(xiàn)對飲用水中上述四種致病菌的準(zhǔn)確檢測，具有特異性好、標(biāo)準(zhǔn)誤差小、檢測時間短、節(jié)約試劑成本等優(yōu)點，適于檢測飲用水標(biāo)準(zhǔn)中的致病菌指標(biāo)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及檢測飲用水中四種致病菌的四重?zé)晒釶CR引物組、探針組、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

民以食為天，食品安全是社會和諧的基礎(chǔ)支柱，而飲用水質(zhì)量安全更是重中之重。近年來，隨著疾控預(yù)防的研究深入，國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，各級監(jiān)抽細則，均明確了飲用水中致病菌的檢測指標(biāo)。當(dāng)前，針對普通飲用水，該類指標(biāo)主要包括大腸菌群Coliformbacteria、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa，針對飲用礦泉水，該類指標(biāo)主要包括大腸菌群Coliform bacteria、糞鏈球菌Enterococcus faecalis、銅綠假單胞菌P.aeruginosa、產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens，均要求零檢出。

標(biāo)準(zhǔn)方法上，上述致病菌的檢測均采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，存在試劑和培養(yǎng)基種類多達十多種、全程基本為手工操作、陰性檢測時間至少2d和陽性檢測時間可長達5至10d、菌落觀察鑒別和生化反應(yīng)鑒定受人為因素影響較大等情況。隨著分子生物學(xué)在微生物學(xué)中的深入運用，使用PCR技術(shù)檢測飲用水中致病菌也成為可選方法之一。

第一代PCR技術(shù)，通常稱為普通PCR技術(shù)，先設(shè)計物種特異基因的引物，再將樣品DNA和引物及擴增試劑混勻后通過PCR儀對目的基因進行反復(fù)擴增，然后通過電泳對擴增產(chǎn)物進行鑒定，從而判定是否含有該物種源性成分。

第二代PCR技術(shù)為實時定量熒光PCR，通常簡稱熒光PCR。除了設(shè)計物種特異基因的引物外，再設(shè)計一條熒光探針。將樣品DNA、引物、探針及擴增試劑混勻后通過實時定量熒光PCR儀(通常簡稱熒光PCR儀)對目的基因進行反復(fù)擴增，探針的熒光信號累積與基因擴增同步。相對普通PCR，既提升了擴增時的特異性，擴增結(jié)束后也立即獲得檢測結(jié)果。

多重實時定量熒光PCR(以下簡稱多重?zé)晒釶CR)屬于熒光PCR的一種，針對多個物種特異基因，逐個設(shè)計引物和探針，不同探針分別標(biāo)記上不同波長的熒光基團。將樣品DNA、引物、探針及擴增試劑混勻后通過多通道熒光PCR儀對多個目的基因進行反復(fù)擴增，通過監(jiān)測多個熒光信號達到同時檢測多個目的基因的要求。相對普通熒光PCR，每增加一套引物和探針即可將檢測效率提升一倍、并將其他試劑成本降低一倍。

涉及致病菌檢測的PCR技術(shù)，已有較廣泛的報道，但多為普通PCR方法和單重?zé)晒釶CR方法。僅有幾種為多重?zé)晒釶CR方法，如專利申請200410091917.3《多重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法》、200810071105.0《食源性致病菌的檢測方法》、201410057135.1《一種基于多色上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記同時檢測三種食源性致病菌的方法》等。這些專利申請在檢測樣品和檢測對象上與飲用水標(biāo)準(zhǔn)要求相差較大，且存在試劑種類繁多、操作步驟復(fù)雜等問題。因此，提供一種適于標(biāo)準(zhǔn)要求和便于操作判定的飲用水中致病菌檢測的多重?zé)晒釶CR引物組、探針組、試劑盒及方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明對大腸菌群Coliform bacteria、糞鏈球菌E.faecalis、銅綠假單胞菌P.aeruginosa、產(chǎn)氣莢膜梭菌C.perfringens設(shè)計特異性的引物組和探針組，各引物和探針不會造成相互干擾，僅能對特定目標(biāo)序列進行擴增并激發(fā)熒光信號，對非目標(biāo)序列無擴增和熒光信號，可以實現(xiàn)對飲用水中致病菌的準(zhǔn)確檢測，具有特異性好、標(biāo)準(zhǔn)誤差小、檢測時間短、節(jié)約試劑成本等優(yōu)點。