[發明專利]檢測飲用水中四種致病菌的四重熒光PCR引物組、探針組、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201711126058.0
• 申請日: 2017-11-15
• 公開（公告）號: CN108004334B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 孫端方;羅紹楠;左澤彥;董睿;李春宇;田志強;張謙;黃家瑞
• 申請（專利權）人: 貴州省產品質量檢驗檢測院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州瑞之凡知識產權代理事務所(普通合伙) 44514
• 代理人: 黃愛君

1.檢測飲用水中四種致病菌的四重熒光PCR引物組，其特征在于：包括針對大腸菌群、糞鏈球菌、銅綠假單胞菌、產氣莢膜梭菌的四對引物：大腸菌群的上游引物為Seq.ID No.1，下游引物為Seq.ID No.2；糞鏈球菌的上游引物為Seq.ID No.3；下游引物為Seq.ID No.4；銅綠假單胞菌的上游引物為Seq.ID No.5；下游引物為Seq.ID No.6；產氣莢膜梭菌的上游引物為Seq.ID No.7；下游引物為Seq.ID No.8。

2.檢測飲用水中四種致病菌的四重熒光PCR探針組，其特征在于：包括針對大腸菌群、糞鏈球菌、銅綠假單胞菌、產氣莢膜梭菌的四重熒光PCR探針組：大腸菌群的探針為Seq.IDNo.9，5’端用FAM熒光激發基團修飾；糞鏈球菌的探針為Seq.ID No.10，5’端用VIC熒光激發基團修飾；銅綠假單胞菌的探針為Seq.ID No.11，5’端用NED熒光激發基團修飾；產氣莢膜梭菌的探針為Seq.ID No.12，5’端用Cy5熒光激發基團修飾，所述探針3’端分別用NFQ-MGB熒光淬滅基團修飾。

3.檢測飲用水中四種致病菌的四重熒光PCR試劑盒，其特征在于：包括權利要求1所述的PCR引物組、權利要求2所述的PCR探針組、熒光PCR試劑、陽性對照、陰性對照。

4.根據權利要求3所述的檢測飲用水中四種致病菌的四重熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述陽性對照為用權利要求1所述的引物組進行擴增，并用權利要求2所述的探針組檢測的混合DNA片段或基因組，濃度為10⁵copies/μL級。

5.根據權利要求3所述的檢測飲用水中四種致病菌的四重熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述陰性對照為所述四種致病菌以外的細菌DNA。

6.根據權利要求3所述的檢測飲用水中四種致病菌的四重熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述大腸菌群、糞鏈球菌、銅綠假單胞菌、產氣莢膜梭菌的上游引物、下游引物和探針的濃度均為10μmol/L。

7.檢測飲用水中四種致病菌的四重熒光PCR方法，其特征在于：包括如下步驟：

①將水樣過0.22μm濾膜，洗脫濾膜富集微生物并提取DNA，或將濾膜置于待測致病菌選擇培養基增菌后提取DNA；

②建立包括權利要求1所述的PCR引物組和權利要求2所述的PCR探針組的四重熒光PCR反應體系，反應條件為：95℃ 20s–2min或10–15min；95℃ 5–60s，60℃ 20s–2min；40cycle并收集熒光信號。

8.根據權利要求7所述的檢測飲用水中四種致病菌的四重熒光PCR方法，其特征在于：所述檢測結果的判斷包括：

①質控標準：陽性對照的FAM、VIC、NED、Cy5均有熒光對數增長，且Ct值≤30.0，陰性對照和空白對照均無熒光信號和熒光對數增長，Ct值≥40.0，可進行②的致病菌檢測；

②結果判定：水樣的FAM或/和VIC或/和NED或/和Cy5有熒光對數增長，且Ct值≤30.0時，則含有相應的大腸菌群或/和糞鏈球菌或/和銅綠假單胞菌或/和產氣莢膜梭菌；若上述一種或多種熒光無信號及對數增長，且Ct值≥40.0，則不含相應的致病菌；若30.0Ct值40.0時，增加模板量復檢，如果Ct值≥40.0，則檢測結果為陰性，如果Ct值40.0，則檢測結果為陽性。