[發(fā)明專利]一種含有布氏乳桿菌的飼料青貯劑及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711124247.4
• 申請(qǐng)日: 2017-11-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108330080B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李雪平;劉建芳;尹望;杜志琳;劉愛(ài)君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京好實(shí)沃生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;A23K30/18;C12R1/225;C12R1/25;C12R1/07
• 代理公司: 北京匯澤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

1.一種含有布氏乳桿菌的飼料青貯劑，其特征在于，所述青貯劑包括布氏乳桿菌、植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌；其中，所述布氏乳桿菌已于2017年8月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.14508，分類命名為Lactobacillus buchneri，所述植物乳桿菌已于2016年5月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.12554，分類命名為Lactobacillus plantarum；所述凝結(jié)芽孢桿菌已于2016年5月27日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.12553，分類命名為Bacillus coagulans；

按重量百分比計(jì)，所述布氏乳桿菌、植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌三者之間的比例為（0.1-1.0）：（0.1-0.5）：0.1； 所述青貯劑中布氏乳桿菌活性達(dá)1×10¹⁰-1×10¹¹CFU/g，植物乳桿菌活性達(dá)1×10¹⁰-5×10¹⁰CFU/g，凝結(jié)芽孢桿菌活性為1×10¹⁰-3×10¹⁰CFU/g。

2.一種權(quán)利要求1所述的含有布氏乳桿菌的飼料青貯劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

⑴菌株擴(kuò)大培養(yǎng)：布氏乳桿菌、植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌分別進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)

培養(yǎng)，最終獲得它們的發(fā)酵液；

⑵活性菌泥的收集：分別將獲得的布氏乳桿菌、植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌的三級(jí)發(fā)酵液在8000-14000r/m的轉(zhuǎn)速下離心20-30min，獲得它們的活性菌泥；

⑶青貯劑的制備：將離心獲得的三種菌的活性菌泥與保護(hù)劑按比例混合，通過(guò)真空冷凍干燥技術(shù)凍干成粉末，制得含有布氏乳桿菌的飼料青貯劑。

3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟⑴中，

所述布氏乳桿菌的發(fā)酵方法為：將甘油管保藏的布氏乳桿菌在MRS平板上劃線，30℃，48h，從平板上挑取單菌落于100mL種子培養(yǎng)基中，30℃，180r/min震蕩培養(yǎng)24h，獲得種子液；取活菌濃度以10⁹CFU/mL計(jì)的種子液1-5mL，接種到300mL培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)獲得一級(jí)種子液，發(fā)酵溫度25-40℃，轉(zhuǎn)速為120-200r/min，發(fā)酵時(shí)間15-30h；將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接到50L發(fā)酵罐的二級(jí)種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵，得二級(jí)種子液，將二級(jí)種子液轉(zhuǎn)接于5T發(fā)酵罐的三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行三級(jí)發(fā)酵，得三級(jí)發(fā)酵液；其中二級(jí)和三級(jí)培養(yǎng)發(fā)酵條件如下，裝液量為35-65%（v/v），接種量為0.5-4%（v/v），發(fā)酵溫度為25-40℃，攪拌轉(zhuǎn)速為80-150r/min，二級(jí)發(fā)酵時(shí)間為3-10h，三級(jí)發(fā)酵時(shí)間為16-30h；

所述植物乳桿菌的發(fā)酵方法為：將植物乳桿菌在MRS斜面上劃線，37℃培養(yǎng)20h，將斜面加入2mL，0.85wt%滅菌生理鹽水制成菌懸液，將菌懸液轉(zhuǎn)接于300mL種子培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，37℃、180r/min震蕩15h，制成種子液；取活菌濃度以10⁹CFU/mL計(jì)的種子液1-5mL，接種到300mL一級(jí)種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)獲得一級(jí)種子液，其中發(fā)酵溫度30-45℃，轉(zhuǎn)速為150-220r/m，發(fā)酵時(shí)間5-20h；將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接于50L發(fā)酵罐的二級(jí)種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵，獲得二級(jí)種子液；將二級(jí)種子液轉(zhuǎn)接于5T發(fā)酵罐的三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行三級(jí)發(fā)酵，得三級(jí)發(fā)酵液；二級(jí)和三級(jí)培養(yǎng)發(fā)酵條件如下，裝液量為40-80%（v/v），接種量為40-80%（v/v），發(fā)酵溫度為30-45℃，攪拌轉(zhuǎn)速100-220r/min，二級(jí)發(fā)酵時(shí)間5-20h，三級(jí)發(fā)酵時(shí)間10-25h；

所述凝結(jié)芽孢桿菌的發(fā)酵方法為：取甘油管保藏的凝結(jié)芽孢桿菌菌種，接種于300mL一級(jí)種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為37-40℃、轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵時(shí)間15-25h，得到活菌濃度為10⁹ CFU/mL的一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接到50L發(fā)酵罐的二級(jí)種子培養(yǎng)基中，接種量為2%，裝液量為0.4%（v/v）、發(fā)酵溫度為37-40℃、攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)7-15h得到二級(jí)種子液；將二級(jí)種子液轉(zhuǎn)接于500L發(fā)酵罐的三級(jí)培養(yǎng)基中，裝液量為60%（v/v），接種量為0.6%（v/v），發(fā)酵溫度為37-40℃，pH值6.8，攪拌轉(zhuǎn)速150r/min，發(fā)酵時(shí)間30h，獲得三級(jí)發(fā)酵液，活菌數(shù)達(dá)到6.1×10¹⁰CFU/mL。