[發明專利]AAVS1位點定點整合外源基因的人iPS細胞的構建方法

有效

• 申請號: 201711123952.2
• 申請日: 2017-11-14
• 公開（公告）號: CN107937441B
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 劉曉玫;張春;姜巖;袁運;魏靜;王東鑫;王飛飛;魏崢;曹金晶
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N5/10
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理有限公司 11369
• 代理人: 韓飛

本發明提供了一種AAVS1位點定點整合外源基因的人iPS細胞的構建方法，其包括：構建含有外源基因的第一重組質粒，并將其包裝得到第一rAAV；構建含有AAV Rep78的第二重組質粒，并將其包裝得到第二rAAV；第一rAAV和第二rAAV共同轉導人成體細胞，將外源基因定點整合于人成體細胞19號染色體的AAVS1位點。采用本發明技術手段得到的基因工程化人成體細胞株能夠穩定表達外源基因，將得到的基因工程化人成體細胞株在體外誘導成多能干細胞，能保持干細胞的多能性及分化潛能，并且穩定表達外源基因。本發明可用于賦予細胞新的功能，或用于糾正/補償由于基因異常/缺陷所引起的疾病，或為干細胞基因治療提供一種可行的方法。

技術領域

本發明涉及人iPS細胞的一種構建方法。更具體地說，本發明涉及一種AAVS1位點定點整合外源基因的人iPS細胞的構建方法。

背景技術

誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS細胞)是一類由分化的體細胞(如成纖維細胞，血細胞)經過重編程而生成的細胞。iPS細胞與胚胎干細胞一樣，幾乎能夠分化形成所有類型的細胞；而iPS細胞的來源與胚胎干細胞不同，iPS細胞來自于分化的體細胞，而非胚胎，可避免使用胚胎干細胞的倫理學上的爭議。iPS細胞與成體干細胞也不同，成體干細胞是在人體中自然產生，數量較少，限制了其在生物醫學中的應用。

2006年，日本科學家山中伸彌(Shinya Yamanaka)發明了將小鼠的成纖維細胞誘導生成多能干細胞的方法，他利用逆轉錄病毒載體將四個轉錄因子Oct-3/4、SOX2、c-Myc和Klf4轉入分化的體細胞中，使其重新編程得到了iPS細胞[參見Takahashi K,Yamanaka S,2006.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adultfibroblast cultures by defined factors.Cell 126:663-676]。2007年，他將該方法應用到了人類皮膚成纖維細胞[參見Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,Narita M,IchisakaT,Tomoda K,Yamanaka S,2007.Induction of pluripotent stem cells from adulthuman fibroblasts by defined factors.Cell 131:861-872]，山中伸彌教授也因此獲得了2012年諾貝爾醫學生理學獎。James Thomson的研究組也同時報道了用慢病毒載體引入Oct4、Sox2加Nanog和LIN28這四個因子誘導產生人類iPS細胞[參見Yu J,Vodyanik MA,Smuga-Otto K,Antosiewicz-Bourget J,Frane JL,Tian S,Nie J,Jonsdottir GA,RuottiV,Stewart R,et al.2007.Induced pluripotent stem cell lines derived from humansomatic cells.Science 318:1917-1920]。2009年James Thomson的研究組使用非整合型附著體載體將成纖維細胞誘導生成iPS細胞，去除非整合型附著體后得到的iPS細胞中不含有外源基因，這是iPS細胞將被應用于生物醫學的一大進步[參見Yu J,Hu K,Smuga-OttoK,Tian S,Stewart R,Slukvin II,Thomson JA,2009.Human Induced Pluripotent StemCells Free of Vector and Transgene Sequences.Science 324:797-801]。2013年北京大學生命科學學院鄧宏魁教授和趙揚博士帶領的研究團隊使用小分子化合物誘導體細胞重編程為iPS細胞，開辟了一條全新的實現體細胞重編程形成iPS細胞的途徑[參見Hou PP,Li YQ,Zhang X,Liu C,Guan JY,Li HG,Zhao T,Ye JQ,Zhao Y,Deng HK,2013.Pluripotentstem cells induced from mouse somatic cells by small-moleculecompounds.Science 341:651-654]。