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[發(fā)明專利]AAVS1位點(diǎn)定點(diǎn)整合外源基因的人iPS細(xì)胞的構(gòu)建方法有效

專利信息
申請(qǐng)?zhí)枺?/td> 201711123952.2 申請(qǐng)日: 2017-11-14
公開(公告)號(hào): CN107937441B 公開(公告)日: 2021-02-26
發(fā)明(設(shè)計(jì))人: 劉曉玫;張春;姜巖;袁運(yùn);魏靜;王東鑫;王飛飛;魏崢;曹金晶 申請(qǐng)(專利權(quán))人: 中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所
主分類號(hào): C12N15/864 分類號(hào): C12N15/864;C12N5/10
代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369 代理人: 韓飛
地址: 215163 江蘇*** 國(guó)省代碼: 江蘇;32
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摘要:
搜索關(guān)鍵詞: aavs1 定點(diǎn) 整合 基因 ips 細(xì)胞 構(gòu)建 方法
【說明書】:

發(fā)明提供了一種AAVS1位點(diǎn)定點(diǎn)整合外源基因的人iPS細(xì)胞的構(gòu)建方法,其包括:構(gòu)建含有外源基因的第一重組質(zhì)粒,并將其包裝得到第一rAAV;構(gòu)建含有AAV Rep78的第二重組質(zhì)粒,并將其包裝得到第二rAAV;第一rAAV和第二rAAV共同轉(zhuǎn)導(dǎo)人成體細(xì)胞,將外源基因定點(diǎn)整合于人成體細(xì)胞19號(hào)染色體的AAVS1位點(diǎn)。采用本發(fā)明技術(shù)手段得到的基因工程化人成體細(xì)胞株能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因,將得到的基因工程化人成體細(xì)胞株在體外誘導(dǎo)成多能干細(xì)胞,能保持干細(xì)胞的多能性及分化潛能,并且穩(wěn)定表達(dá)外源基因。本發(fā)明可用于賦予細(xì)胞新的功能,或用于糾正/補(bǔ)償由于基因異常/缺陷所引起的疾病,或?yàn)楦杉?xì)胞基因治療提供一種可行的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及人iPS細(xì)胞的一種構(gòu)建方法。更具體地說,本發(fā)明涉及一種AAVS1位點(diǎn)定點(diǎn)整合外源基因的人iPS細(xì)胞的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS細(xì)胞)是一類由分化的體細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞,血細(xì)胞)經(jīng)過重編程而生成的細(xì)胞。iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞一樣,幾乎能夠分化形成所有類型的細(xì)胞;而iPS細(xì)胞的來源與胚胎干細(xì)胞不同,iPS細(xì)胞來自于分化的體細(xì)胞,而非胚胎,可避免使用胚胎干細(xì)胞的倫理學(xué)上的爭(zhēng)議。iPS細(xì)胞與成體干細(xì)胞也不同,成體干細(xì)胞是在人體中自然產(chǎn)生,數(shù)量較少,限制了其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

2006年,日本科學(xué)家山中伸彌(Shinya Yamanaka)發(fā)明了將小鼠的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)生成多能干細(xì)胞的方法,他利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct-3/4、SOX2、c-Myc和Klf4轉(zhuǎn)入分化的體細(xì)胞中,使其重新編程得到了iPS細(xì)胞[參見Takahashi K,Yamanaka S,2006.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adultfibroblast cultures by defined factors.Cell 126:663-676]。2007年,他將該方法應(yīng)用到了人類皮膚成纖維細(xì)胞[參見Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,Narita M,IchisakaT,Tomoda K,Yamanaka S,2007.Induction of pluripotent stem cells from adulthuman fibroblasts by defined factors.Cell 131:861-872],山中伸彌教授也因此獲得了2012年諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)。James Thomson的研究組也同時(shí)報(bào)道了用慢病毒載體引入Oct4、Sox2加Nanog和LIN28這四個(gè)因子誘導(dǎo)產(chǎn)生人類iPS細(xì)胞[參見Yu J,Vodyanik MA,Smuga-Otto K,Antosiewicz-Bourget J,Frane JL,Tian S,Nie J,Jonsdottir GA,RuottiV,Stewart R,et al.2007.Induced pluripotent stem cell lines derived from humansomatic cells.Science 318:1917-1920]。2009年James Thomson的研究組使用非整合型附著體載體將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)生成iPS細(xì)胞,去除非整合型附著體后得到的iPS細(xì)胞中不含有外源基因,這是iPS細(xì)胞將被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的一大進(jìn)步[參見Yu J,Hu K,Smuga-OttoK,Tian S,Stewart R,Slukvin II,Thomson JA,2009.Human Induced Pluripotent StemCells Free of Vector and Transgene Sequences.Science 324:797-801]。2013年北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鄧宏魁教授和趙揚(yáng)博士帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)使用小分子化合物誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞,開辟了一條全新的實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程形成iPS細(xì)胞的途徑[參見Hou PP,Li YQ,Zhang X,Liu C,Guan JY,Li HG,Zhao T,Ye JQ,Zhao Y,Deng HK,2013.Pluripotentstem cells induced from mouse somatic cells by small-moleculecompounds.Science 341:651-654]。

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