[發明專利]撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體K179M

有效

• 申請號: 201711123463.7
• 申請日: 2017-11-14
• 公開（公告）號: CN107841489B
• 公開（公告）日: 2020-02-18
• 發明（設計）人: 祝連彩;撖菁萱;姚愷怡;唐士金;王伯初;季順林;婁德帥;譚君
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12P33/02
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 呂小琴

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種撒丁島梭菌7α?羥基類固醇脫氫酶突變體K179M，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，是核酸序列為SEQ ID NO：1的7α?羥基類固醇脫氫酶的第179位氨基酸由賴氨酸變為甲硫氨酸所得。該突變體對TCDCA的催化比活力是野生型的2.9倍。本發明的K179M突變體在生物轉化TCDCA獲得TUDCA的工業生產過程中具有巨大的應用潛力。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體K179M。

背景技術

羰基的不對稱還原一直是化學反應研究的熱點之一。雖然目前化學方法已經取得了一定的成果，但是化學方法往往存在催化劑種類和數目有限、立體選擇性不高、輔助試劑昂貴且不易回收等缺點。而酶促反應不僅具有高效性、化學選擇性、區域選擇性還具有高度的立體選擇性。羥基類固醇脫氫酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)介導的酶促反應具有相對嚴格的立體選擇性和“不嚴格”的底物特異性。例如，早在二十世紀八十年代初科學家就已經開始嘗試利用微生物產生的7α-、7β-HSDH聯合差向異構轉化鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)合成熊去氧膽酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)，轉化的過程如圖1所示。而游離酶還可以催化結合態膽汁酸——牛磺鵝去氧膽酸(Taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)轉化為牛磺熊去氧膽酸(Tauroursodeoxycholicacid，TUDCA)。

HSDH的底物不僅僅局限在甾體類化合物，文獻報道HSDH還可以催化烷基取代單環酮類、二環酮類等物質的羰基不對稱還原。HSDH所具有的優秀催化品質決定了其在生物轉化領域具有較大應用潛力。然而，活性更高的HSDH改造體是其在生物轉化領域進一步應用的基本保障。近年來，科研人員逐漸認識到了7α-、7β-HSDH在生物轉化領域所具有的巨大應用潛力。目前，本領域現存的7α-HSDH共有5個，它們分別來自于Bacteroidesfragilis、Clostridium scindens、Clostridium sordellii、Clostridium absonum和Escherichiacoli。上述雙酶偶聯構建的生物轉化體系不但克服了輔酶循環難題，還實現了氧化、還原“一鍋式”進行特定化學區域的羥基差向異構。

酶的熱穩定性較低是限制其工業應用的主要因素之一，因此，如何提高酶活及酶穩定性，并開發一種酶活和穩定性都很好的酶，是本領域目前急需解決的問題。

發明內容

為滿足上述領域存在的需求，本發明提供一種撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶(CA7α-HSDH)突變體，具有更高的催化效率，可用于多種底物的生物轉化，在工業生產中有巨大的應用價值。

本發明請求保護的技術方案如下：

一種提高野生型撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶的酶活及穩定性的方法，其特征在于，將所述野生型撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶第179位的賴氨酸突變為甲硫氨酸。

所述野生型撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；進行所述突變后得到的撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶酶突變體的酶活及穩定性相較所述野生型撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶顯著提高。

一種撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體K179M，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

編碼所述的撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體K179M的基因。

所述基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

一種表達盒，其包含所述的基因。

一種載體，其包含所述的基因，和/或所述的表達盒。