[發明專利]檢測O?乙酰葡萄糖胺轉移酶的納米傳感器及其檢測方法

在審

• 申請號: 201711120925.X
• 申請日: 2017-11-14
• 公開（公告）號: CN107723339A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 張春陽;胡娟;李玥穎
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;G01N21/64
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司37221
• 代理人: 王志坤

技術領域

本發明屬于生物分析檢測技術領域，具體涉及一種基于單個量子點檢測O-乙酰葡萄糖胺轉移酶的納米傳感器及其檢測方法。

背景技術

蛋白糖基化是一種普遍存在的翻譯后修飾，其中蛋白是由一個氧連接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)單體修飾在絲氨酸或蘇氨酸殘基，被稱為氧連接型乙酰葡萄糖胺糖基化。O-GlcNAc在多種細胞過程中起著重要作用，包括信號傳導，基因表達，蛋白質降解，新陳代謝，生物周期節律，和神經退行性疾病。人類氧連接乙酰葡萄糖胺轉移酶(OGT)是一種細胞內源酶，催化從尿苷-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)的GlcNAc單體轉移到蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基形成的GlcNAc-β-絲氨酸/蘇氨酸，而OGT活性的失調與多種疾病相關，如癌癥，糖尿病，阿爾茲海默癥。因此，OGT可能成為疾病治療的潛在治療靶標。

目前，檢測OGT活性普遍通過監測放射性標記的糖基從糖供體(例如，UDP-[3H]-GlcNAc)轉移到蛋白底物(例如，Nup62)來測量。但放射性標記的方法涉及昂貴的標記試劑和繁瑣的分離程序。為了克服這些限制，多種非放射性方法已經被開發用于檢測OGT，包括吸附酶聯免疫測定(ELISA)，疊氮化-ELISA，鎳-氨三乙酸板免疫測定法，抗蛋白酶裂解熒光共振能量轉移(FRET)方法等。然而，這些方法因為需要轉移溶液相酶反應產物到微孔板，特異性抗體(例如，特定的糖肽單克隆抗體，抗四甲基羅丹明抗體)，熒光UDP-GlcNAc的類似物的復雜化學合成，設計復雜的FRET染料對等，所以效率低、靈敏度相對較差。此外，OGT是對溫度敏感的酶，并且在酶純化過程中可能發生的酶活性的損失，因此定量檢測實際樣品中細胞內OGT活性是一個巨大的挑戰。

因此，迫切需要開發一種不需要酶純化過程的能夠簡單、快速的定量檢測OGT活性和篩選OGT抑制劑的方法。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種基于單個量子點檢測O-乙酰葡萄糖胺轉移酶的納米傳感器及其檢測方法，本發明納米傳感器檢測方法非常簡單，不需要進行酶純化，不需要放射性同位素標記的糖供體、特異性抗體和熒光UDP-GlcNAc類似物的合成，并且檢測限可降低至3.47×10^-13摩爾每升，具有非常高的靈敏度。

本發明通過以下技術方案實現：

本發明目的之一是：提供一種基于單個量子點檢測O-乙酰葡萄糖胺轉移酶的納米傳感器，其包括：花菁5/生物素修飾的肽鏈；非放射性尿苷-乙酰葡萄糖胺，蛋白酶K和被鏈霉親和素包被的量子點。

本發明目的之二是：提供一種基于單個量子點檢測O-乙酰葡萄糖胺轉移酶的納米傳感器的檢測方法，包括以下步驟：

S1.由糖供體尿苷-乙酰葡萄糖胺的糖基將花菁5/生物素修飾的肽糖基化；

S2.蛋白酶K區分糖基化和非糖基化肽；

S3.糖基化的肽通過鏈霉親和素和生物素的相互作用自組裝到量子點表面形成量子點-肽-花菁5的納米結構和后續的熒光共振能量轉移信號的測量。

本發明目的之三是：提供上述納米傳感器在酶動力學參數的測量、OGT抑制劑的篩選以及細胞OGT活性的定量檢測方面的應用。

本發明納米傳感器以花菁5(Cy5)/生物素(biotin)修飾的肽鏈作為底物，此肽鏈具有能夠被OGT糖基化的絲氨酸和與之相鄰的蛋白酶識別的位點，用普通的非放射性UDP-GlcNAc的作為糖基供體。在OGT的存在下，它催化糖基化反應以產生糖基化的肽，肽鏈的糖基能夠保護其不被蛋白酶裂解。再加入被鏈霉親和素包被的量子點(QD)，該糖基化的Cy5/生物素修飾的肽通過生物素-鏈霉親和素的相互作用可連接到QD表面，以形成QD-肽-Cy5的納米結構，從而在QD和Cy5之間能夠發生FRET。

與現有技術相比，本發明具有以下技術優點：

(1)本發明納米傳感器具有極高的靈敏度：本技術方案中利用OGT誘導的花菁5/生物素修飾的肽的糖基化和隨后蛋白酶K裂解可以區分糖基化的肽和非糖基化的肽，并且本發明將多個的糖基化的底物肽組裝到單一QD表面因而使得FRET效率高，此外，本發明使用單分子檢測，其具有高信噪比的優點，因此，本發明納米傳感器具有極好的選擇性以及非常高的靈敏度；

(2)本發明納米傳感器原理簡單，成本低：整個過程不需要酶的純化，也不許需要合成放射性標記的糖供體和特異性的抗體以及具有熒光基團的UDP-GlcNAc同源物；

(3)能夠檢測實際樣品中細胞內的OGT活性。

附圖說明

圖1是本發明納米傳感器的機理圖。