[發(fā)明專(zhuān)利]用于多重PCR文庫(kù)構(gòu)建的連接序列及其設(shè)計(jì)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711111664.5
• 申請(qǐng)日: 2017-11-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107988219B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 糜慶豐;朱鵬遠(yuǎn);吳春求;黃銓飛;王楊;周幸芝;呂來(lái)灰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 東莞博奧木華基因科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/11
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/11;C12Q1/6811;C40B50/06
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開(kāi)了用于多重PCR文庫(kù)構(gòu)建的連接序列及其設(shè)計(jì)方法。基于本發(fā)明的連接序列能通過(guò)PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)標(biāo)簽、測(cè)序接頭、目標(biāo)片段的連接，其設(shè)計(jì)方法包括：獲取候選序列集、候選序列初篩、e?PCR分析；本發(fā)明的連接序列排除了與擴(kuò)增體系中其他序列的相互干擾，構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量好，并且通用性強(qiáng)，不僅適于一步和兩步擴(kuò)增建庫(kù)，還適于多種核酸測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建，如檢測(cè)遺傳性耳聾致病位點(diǎn)、苯丙酮尿癥致病基因、肺癌靶向用藥基因、乳腺癌BRCA1/2突變基因、安全用藥基因的測(cè)序文庫(kù)，基于連接序列的文庫(kù)構(gòu)建簡(jiǎn)化了建庫(kù)流程，大大節(jié)約測(cè)序成本，還可應(yīng)用于核酸測(cè)序試劑盒中，具有非常良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于高通量測(cè)序領(lǐng)域，更具體地涉及用于多重PCR文庫(kù)構(gòu)建的連接序列及其設(shè)計(jì)方法。

背景技術(shù)

核酸測(cè)序已經(jīng)成為生物學(xué)研究、疾病篩查、醫(yī)學(xué)輔助診斷中不可缺少的一項(xiàng)重要技術(shù)，從根本上改變了人類(lèi)研究生命藍(lán)圖的方式。高通量測(cè)序是目前主流的核酸測(cè)序方法，其具有費(fèi)用低、通量大、速度快的優(yōu)勢(shì)。現(xiàn)有的高通量測(cè)序平臺(tái)主要包括Illumina公司的Solexa測(cè)序平臺(tái)、Roche公司的454平臺(tái)、Life公司的Ion torrent平臺(tái)。

隨著測(cè)序平臺(tái)硬件及軟件的提升，阻礙高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展的卻是文庫(kù)構(gòu)建以及后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。其中，所有測(cè)序平臺(tái)都涉及復(fù)雜的文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程，一方面需要捕獲目標(biāo)片段，另一方面還需要將平臺(tái)配套的測(cè)序接頭和區(qū)分樣本的標(biāo)簽連接到捕獲片段上。以基于多重PCR捕獲的文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程為例，基礎(chǔ)方法包括如下步驟：(1)多重PCR捕獲目的片段；(2)引物和/或修飾清除；(3)測(cè)序接頭和/或標(biāo)簽連接；(4)磁珠純化；(5)PCR擴(kuò)增富集。在此基礎(chǔ)流程上做出的改進(jìn)主要有：(1)測(cè)序接頭和標(biāo)簽的連接與PCR擴(kuò)增合并為一步；(2)多重PCR捕獲目標(biāo)片段與測(cè)序接頭和/或標(biāo)簽連接合并為一步；(3)無(wú)引物和/或修飾清除步驟，(4)以上情況的組合等等，其主要目的都是簡(jiǎn)化流程，節(jié)約成本。文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程的簡(jiǎn)化并非易事，每個(gè)步驟的改進(jìn)或去除都會(huì)影響文庫(kù)構(gòu)建的質(zhì)量，如文庫(kù)濃度，文庫(kù)片段分布，進(jìn)而影響擴(kuò)增子均一性、數(shù)據(jù)利用率等。此外，更不容忽視的是，PCR測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，涉及的反應(yīng)序列復(fù)雜多樣，如特異性引物序列、測(cè)序接頭序列、多個(gè)標(biāo)簽序列等等，如何在建庫(kù)步驟中排除或降低序列之間的相互干擾，獲得良好的文庫(kù)質(zhì)量，并且兼顧序列的通用性，是需要設(shè)計(jì)者有創(chuàng)造性地去設(shè)計(jì)和改進(jìn)才能實(shí)現(xiàn)的。

發(fā)明內(nèi)容

基于背景技術(shù)談及的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于多重PCR文庫(kù)構(gòu)建的連接序列及其設(shè)計(jì)方法；還提供以上連接序列和基于連接序列構(gòu)成的連接引物、連接接頭、連接標(biāo)簽在核酸測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建和制備核酸測(cè)序試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種用于多重PCR文庫(kù)構(gòu)建的連接序列，所述連接序列設(shè)置于目標(biāo)片段特異性引物的5’端，構(gòu)成連接引物；所述連接序列還設(shè)置于測(cè)序接頭的3’端，構(gòu)成連接接頭；基于連接序列的設(shè)置，通過(guò)PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)目標(biāo)片段與測(cè)序接頭的連接。

作為上述連接序列的改進(jìn)，所述連接序列還可設(shè)置于標(biāo)簽的3’端，構(gòu)成連接標(biāo)簽，通過(guò)PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)標(biāo)簽、測(cè)序接頭、目標(biāo)片段的連接。

作為上述連接序列的優(yōu)選，所述連接序列選自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任意一條核苷酸序列。

作為上述連接序列的優(yōu)選，所述連接序列用于Ion torrent測(cè)序平臺(tái)。

作為上述連接序列的優(yōu)選，所述連接序列適用于人核酸測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建。

如上所述的連接序列的設(shè)計(jì)方法，包括如下步驟：

獲取候選序列集：采用滑窗法構(gòu)建人類(lèi)遠(yuǎn)源物種基因組核苷酸序列集N和人類(lèi)基因組核苷酸序列集M，將序列集M中出現(xiàn)的序列從序列集N中剔除，獲得候選序列集；

候選序列初篩：在候選序列集中，篩選滿(mǎn)足以下條件的序列：