[發明專利]一種藍莓的高效快速穩定基因轉化方法

有效

• 申請號: 201711105959.1
• 申請日: 2017-11-10
• 公開（公告）號: CN107653264B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 宋楊;劉鳳之;張紅軍;王海波;劉紅弟
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院果樹研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/36
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 李振瑞

本發明屬于基因轉化方法技術領域，具體涉及一種藍莓的高效快速穩定基因轉化方法。包括以下步驟：外植體的準備；農桿菌的準備；外植體的一級共培養轉化；誘導培養；愈傷組織的二級共培養轉化；轉基因植株的培養篩選等步驟。本發明綜合考慮到藍莓組織中纖維素等細胞成分基因轉化過程的影響，對現有的農桿菌介導的基因轉化方法進行改進，分別在幼嫩組織期和愈傷組織期進行農桿菌的共培養轉化，基因轉化成功率可達25.7％以上，且基因轉化藍莓幼苗分化成活率達99％以上，開發出了一種高效、快速、穩定的基因轉化方法。

技術領域

本發明屬于基因轉化方法技術領域，具體涉及一種藍莓的高效快速穩定基因轉化方法。

背景技術

藍莓屬杜鵑花科，越桔屬，果實呈深藍色，球形或扁球形，直徑約1cm，果皮薄，成熟果實呈藍紫色，酸甜適口，可食性高。藍莓果實中含有豐富的多糖、色素、果膠和保留遺傳信息的DNA等物質。由于不同的藍莓品種DNA之間存在差異，研究DNA與藍莓表型之間的相互關系。轉基因打破了不同植物物種之間的界限，使不同種的生物的遺傳物質在分子水平上重新組合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的實現對生物體的改造。因此，選育出具有特殊性狀或生理特性的轉基因藍莓品種是當前藍莓育種的主要研究熱點。

目前，常用的植物轉基因方法包括載體介導法和DNA直接導入法，其中載體介導法又包括農桿菌介導法、病毒介導法。農桿菌介導法是目前雙子葉植物常用的基因轉移方法。它是利用攜帶有目的基因的農桿菌在植物形成腫瘤過程中可以將目的基因導入植物細胞中，進而構建出轉化植株。雖然農桿菌介導的基因轉化方法已經廣泛應用于植物中，但是由于其操作步驟繁瑣，浸染時間長，所以基因轉化的成功率僅不到1％，效率不高。因此，開發一種高效快速穩定的藍莓基因轉化方法極為迫切。

發明內容

本發明提供的一種藍莓的高效快速穩定基因轉化方法，是一種簡化的、可以減少多酚和色素干擾的藍莓果實總DNA提取方法，能夠避免色素對DNA純度的影響。

本發明目的是提供一種藍莓的高效快速穩定基因轉化方法，包括以下步驟：

S1，外植體的準備：切取藍莓組織，浸泡于消毒液中除菌，無菌水清洗，瀝干水分，得到外植體，備用；

S2，農桿菌的準備：將含有目的基因的農桿菌擴繁培養至菌體濃度OD₆₀₀＝0.4-0.8，培養溫度為28±1℃，得到農桿菌菌液，備用；

S3，一級共培養轉化：將無菌紗布浸泡于農桿菌菌液中10min，取出，瀝掉多余菌液，將外植體包裹于紗布內，28±1℃孵育12h；加入篩選培養基，150-220rpm、28±1℃暗室培養24-48h，得到一級轉化處理組織；

每升所述篩選培養基的配方如下：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化鈉5g、羧甲基纖維素1g、果膠1g、抗菌物質20-50mg，蒸餾水定容至1L，pH 7.0；

S4，誘導培養：將紗布內的一級轉化處理組織取出，無菌水清洗，置于誘導培養基中培養，28±1℃暗室培養1-3周，得到愈傷組織；

S5，二級共培養轉化：將愈傷組織浸泡于農桿菌菌液中，共培養24-48h，得到二級轉化處理組織；

S6，轉基因植株的培養篩選：將所述二級轉化處理組織置于分化篩選培養基中，培養至長出幼苗，得到含有目的基因的轉化藍莓植株；

所述分化篩選培養基由以下比例的組分混合而成：MS基本培養基:黃原膠:抗菌物質＝1L:5-10g:20-50mg。

優選的，上述的藍莓的高效快速穩定基因轉化方法，S1中，所述消毒液為0.5-1.5g/100ml的次氯酸鈉溶液或者體積分數70％乙醇溶液；浸泡時間為20min。

優選的，上述的藍莓的高效快速穩定基因轉化方法，S1中，所述藍莓組織為藍莓幼嫩莖或者藍莓嫩葉。