[發明專利]一種禽流感抗原的濃縮純化方法、禽流感抗原

有效

• 申請號: 201711105661.0
• 申請日: 2017-11-10
• 公開（公告）號: CN107779441B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 徐進;駱愛芳;丁少成;郭曉慶;謝梅梅;李厚偉;樊慧麗
• 申請（專利權）人: 河南后羿生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12N7/00
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

本發明涉及一種禽流感抗原的濃縮純化方法、禽流感抗原，屬于抗原濃縮純化領域。本發明禽流感抗原的濃縮純化方法，包括以下步驟：1)將禽流感病毒液通過1000KD的膜包濃縮至所述病毒液體積的1/10～1/8，得回流液A；2)向回流液A中加入滅菌的PBS使其與步驟1)中的禽流感病毒液體積相同，然后通過1000KD的膜包濃縮至所述病毒液體積的1/10～1/8，得回流液B；3)將回流液B重復步驟2)中的操作1?5次，得回流液C；4)向步驟3)所得回流液C中加入NaCl和PEG6000，混勻，靜置，離心，收集沉淀，即得。本發明濃縮純化方法，雜蛋白去除率可達到95％以上，內毒素含量明顯減少。

技術領域

本發明涉及一種禽流感抗原的濃縮純化方法、禽流感抗原，屬于抗原濃縮純化領域。

背景技術

禽流感(Avian Influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一種對人類和禽類危害極大的傳染性疾病，被國際獸醫局確定為I型烈性傳染病，其特征為從低致病毒株引起的輕度呼吸疾病、產蛋下降到高致病性毒株引起的急性致病性疫病等多種形式。自1988年以來在我國大部分地區仍然不斷發生H9N2亞型AI。近幾年在我國部分商品蛋雞場及養雞專業村的禽流感調查中發現H9亞型AIV陽性雞群占總AIV抗體陽性雞群的93.67％，說明在我國大部分地區都存在H9亞型AIV，仍是我國現有AIV的主要亞型。因此禽流感(H9亞型)滅活疫苗仍然是防控的有效手段之一。

目前我國大部分企業仍采用雞胚培養生產禽流感疫苗，制備工藝簡單，免疫效果良好，免疫持續時間長。但是雞胚生產仍然存在一些弊端，雞胚尿囊液中含有蛋白、細胞碎片、脂類等復雜成分，不易去除，制成苗之后免疫商品雞，對雞的應激較大，影響雞的生長性能，尤其是產蛋雞，產蛋率明顯下降。因此，在不增加成本的基礎上，如何去除胚液中存在的異源性物質成為了一個難題。

目前，大部分企業采用300KD膜包濃縮禽流感病毒液，去除的雜質不徹底，仍存在大量殘留；使用蔗糖密度梯度離心、層析等方法純化，生產成本會明顯增加。

申請公布號為CN 106540249A的中國發明專利公開了一種禽流感(H5N1)或豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)病毒疫苗的抗原濃縮純化方法，包括以下步驟：(一)病毒培養和收獲；(二)病毒的滅活；(三)病毒液初步分離：含有滅活的病毒細胞培養液或雞胚尿囊液，經0.65μm濾膜過濾，除去細胞碎片及微粒體，澄清液體；(四)濾膜過濾滅活病毒液：以0.45μm的切向流微濾中空纖維膜過濾設備過濾病毒液；(五)病毒液超濾濃縮：分別使用中空纖維750K和500K超濾柱、300K和500K超濾膜包進行病毒液的濃縮洗濾；(六)將精制純化病毒液按照固定工藝制成疫苗產品；(七)進行病毒毒力滴定、效力測定、蛋白含量測定。該專利公開的抗原濃縮純化方法步驟繁瑣復雜，且雜蛋白去除率有待進一步提高。

發明內容

本發明的目的在于提供一種禽流感抗原的濃縮純化方法，利用該方法得到的禽流感抗原雜蛋白去除率高達95％以上。

本發明的第二個目的在于提供一種禽流感抗原。

為實現上述目的，本發明禽流感抗原的濃縮純化方法的技術方案是：

一種禽流感抗原的濃縮純化方法，包括以下步驟：

1)將H9亞型禽流感病毒液通過孔徑為1000KD的膜包濃縮至所述禽流感病毒液體積的1/10～1/8，得回流液A；

2)向回流液A中加入滅菌的PBS使其與步驟1)中的禽流感病毒液體積相同，然后通過孔徑為1000KD的膜包濃縮至所述禽流感病毒液體積的1/10～1/8，得回流液B；

3)將回流液B重復步驟2)中的操作1-5次，得回流液C；

4)向步驟3)所得回流液C中加入NaCl和PEG6000，混勻，3～5℃靜置，然后離心，收集沉淀，即得。

步驟1)中的H9亞型禽流感病毒液通過以下方法獲得：