[發明專利]PK15細胞馴化懸浮方法和二階病毒生產工藝

在審

• 申請號: 201711098900.4
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN108570445A
• 公開（公告）日: 2018-09-25
• 發明（設計）人: 蔡仕君;王嘉琪
• 申請（專利權）人: 甘肅健順生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00
• 代理公司: 北京律智知識產權代理有限公司 11438
• 代理人: 于寶慶;崔香丹

本發明涉及PK15細胞馴化懸浮方法和二階病毒生產工藝。具體而言，本發明涉及馴化PK15細胞使其適應無血清懸浮培養，并以其為宿主細胞，采用二階培養接毒方式生產能在懸浮PK15細胞上病變或有敏感性的病毒，即，細胞長至2.0～20.0×10⁶細胞/mL時，用生產培養基稀釋1～5倍，使密度在1.0～10.0×10⁶細胞/mL間，然后接毒，或在稀釋前接毒。本發明的懸浮PK15細胞適應在無血清和化學成分確定的培養基中懸浮生長，其二階病毒生產工藝簡單，易放大，不換液，培養基利用率高；生產和生長培養基可相同或不同，二者按照比例混合，即可使細胞二次生長并促進病毒表達。

技術領域

本發明涉及PK15細胞馴化懸浮方法和懸浮PK15細胞相關疫苗生產領域，具體涉及30L及以上的生物反應器培養懸浮PK15細胞、以二階培養方法培養懸浮PK15細胞以生產疫苗的工藝技術。

背景技術

哺乳動物細胞大規模培養技術是生物制藥企業下游通用技術之一，其在該行業發揮極為重要的作用。該項技術的關鍵在于實現哺乳動物細胞的懸浮無血清大規模培養，從而提高產能，降低成本，并易于放大。貼壁細胞培養時的通常做法是在培養基中添加一定量血清使細胞貼壁生長，而血清化學成分不確定，且質量不穩定，有批間差，用此種細胞生產的生物制品，質量難以控制，很難通過食品藥品監督管理局的審批，而懸浮無血清培養相對于常見的貼壁培養來說，單位體積內能生長更多的細胞，從而能生產更多的生物制品。

PK15是豬腎傳代細胞系，其父母代源自1955年美國Stice提供的成年豬腎細胞PK-2a，后被美國ATCC收藏(收藏號為ATCC-CCL33)。PK15細胞現已廣泛應用于豬圓環病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬細小病毒等的分離、體外增殖以及多種獸用疫苗的生產。

現有的PK15細胞馴化懸浮的缺陷在于：1、有的無法實現完全無血清培養；2、一般采用兩步走的方法，即先降為無血清再懸浮培養，由于貼壁培養采用的培養基通常為基礎培養基加血清，基礎培養基營養成分較弱，馴化過程中貼壁培養表面積/體積比通常較小，限制了營養的攝入，整個馴化過程耗時長；3、基因修飾后馴化，即通過基因改造，為貼壁細胞株插入不利于貼壁的基因片段，改變原有的貼壁培養方式，使細胞懸浮生長，然后再通過培養基的不斷優化與改變使細胞能夠無血清高密度生長，此種辦法容易實現，但是插入了外源基因片段，影響產品的質量。因此，需要對PK15細胞的懸浮馴化和無血清馴化方法進一步研究，并克服以上三方面缺陷。

在病毒接毒工藝方面，傳統的病毒性疫苗生產工藝是指細胞生長到一定密度后，換液再接毒或者直接接毒。截至目前，并未有關于懸浮PK15細胞的二階培養方法的相關報道。

發明內容

本發明的第一方面涉及一種懸浮PK15細胞疫苗生產的二階培養方法，其包含如下步驟：

1)細胞生長：懸浮PK15細胞在生長培養基中生長至2.0×10⁶細胞/mL～20.0×10⁶細胞/mL；

2)接毒：接毒量在10^-1～10^-5MOI之間，或者在步驟3)之后按照此接毒量接毒；

3)稀釋/補加生產培養基：用生產培養基稀釋1～5倍，稀釋后細胞密度到1.0×10⁶細胞/mL～10.0×10⁶細胞/mL；

4)二次生長：細胞二次生長；

5)任選地，收獲病毒液純化制苗。

在一些實施方案中，懸浮PK15細胞生長為懸浮罐培養，培養工作體積為30L及以上。