[發明專利]PK15細胞馴化懸浮方法和二階病毒生產工藝

在審

• 申請號: 201711098900.4
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN108570445A
• 公開（公告）日: 2018-09-25
• 發明（設計）人: 蔡仕君;王嘉琪
• 申請（專利權）人: 甘肅健順生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00
• 代理公司: 北京律智知識產權代理有限公司 11438
• 代理人: 于寶慶;崔香丹

1.一種懸浮PK15細胞疫苗生產的二階培養方法，其包含如下步驟：

6)細胞生長：懸浮PK15細胞在生長培養基中生長至2.0×10⁶細胞/mL～20.0×10⁶細胞/mL；

7)接毒：接毒量在10^-1～10^-5MOI之間，或者在步驟3)之后按照此接毒量接毒；

8)稀釋/補加生產培養基：用生產培養基稀釋1～5倍，稀釋后細胞密度到1.0×10⁶細胞/mL～10.0×10⁶細胞/mL；

9)二次生長：細胞二次生長；

10)任選地，收獲病毒液純化制苗。

2.根據權利要求1所述的懸浮PK15細胞疫苗生產的二階培養方法，其中懸浮PK15細胞生長為懸浮罐培養，培養工作體積為30L及以上。

3.根據權利要求1或2所述的懸浮PK15細胞疫苗生產的二階培養方法，其中步驟1)中細胞密度在5.0×10⁶細胞/mL～16.0×10⁶細胞/mL，優選地，6.0×10⁶細胞/mL～15.0×10⁶細胞/mL，最優選地，8.0×10⁶細胞/mL。

4.根據權利要求1至3任一項所述的懸浮PK15細胞疫苗生產的二階培養方法，其中步驟2)中細胞接毒量在10^-1～10^-4MOI之間，更優接的，10^-1～10^-3MOI，最優接的，10^-2MOI。

5.根據權利要求1至4任一項所述的懸浮PK15細胞疫苗生產的二階培養方法，其中步驟3)中懸浮PK15細胞生產培養基稀釋為1～4倍，更優選地，1～3倍稀釋，最優選為2倍稀釋。

6.根據權利要求1至5任一項所述的懸浮PK15細胞疫苗生產的二階培養方法，其中步驟3)中接毒后細胞密度在1.0×10⁶細胞/mL～10.0×10⁶細胞/mL，優選地，1.0×10⁶細胞/mL～5.0×10⁶細胞/mL。

7.根據權利要求1至6任一項所述的懸浮PK15細胞疫苗生產的二階培養方法，其中懸浮PK15細胞為疫苗生產所用的懸浮PK15細胞，或是由貼壁PK15細胞馴化而來、能夠懸浮生長生產的懸浮PK15細胞，優選地，懸浮PK15細胞是由貼壁PK15細胞經低血清馴化或無血清馴化而來，所述無血清馴化是指馴化后的PK15細胞可在無血清存在的培養基中生長、增殖，和/或，優選地，懸浮PK15細胞是由貼壁PK15細胞經懸浮馴化而來。

8.根據權利要求1至7任一項所述的懸浮PK15細胞疫苗生產的二階培養方法，其中病毒為在對應懸浮PK15細胞上敏感、能夠生產出對應疫苗的病毒。

9.根據權利要求1至8任一項所述的懸浮PK15細胞疫苗生產的二階培養方法，其中細胞生長溫度在35℃～37℃，接毒后病毒生產溫度在30℃～37℃。

10.根據權利要求1至9任一項所述的懸浮PK15細胞疫苗生產的二階培養方法，其中細胞生長接種密度在0.3×10⁶細胞/mL～1.0×10⁶細胞/mL，生長天數在2～8天達到最高細胞密度。