[發明專利]抗病毒活性物質Tenecin活性肽的研制實驗方法

在審

• 申請號: 201711098811.X
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN107916272A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 陳偉;景曉雅;樊澤璐;李佳;郭瑞珍;蘭徐智斌;王祎玲
• 申請（專利權）人: 山西師范大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62;C12Q1/18
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及農業技術領域，尤其涉及一種抗病毒活性物質Tenecin活性肽的研制實驗方法。

背景技術

植物病毒病是農業生產的嚴重威脅，每年造成嚴重的經濟損失。有效的防治植物病毒病一直是世界范圍內的難題。長期以來，化學農藥一直是防治植物病毒的首選方法。然而由于化學病毒制劑的長期、大量使用，造成嚴重的“農藥公害”，因此，從生物源尋找與開發新型的高活性抗病毒藥物，不僅具有很高的理論價值，而且在控制作物病毒病綠色生態農業持續發展中具有重要的實踐意義。

發明內容

本發明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種抗病毒活性物質Tenecin活性肽的研制實驗方法。

本發明通過以下技術方案來實現上述目的：

本發明包括實驗材料：選擇50～60日齡黃粉蟲幼蟲，放置在長29cm寬21.5cm高7cm塑料盆中，一周投喂一次精料，一天投喂一次青料，在溫度26℃、濕度60％恒定環境中飼養；

引物：根據GenBank公布的黃粉蟲Tenecin基因序列設計特異引物，

上游引物為：5'-GGGGTACCATGCACGAGATCACGATG-3'，

下游引物：5'-CGGGATCCCTAGACCCTCTTTCCGTT-3'，

并引入KpnI和BamHⅠ酶切位點，擴增片段長度為252bp；

黃粉蟲RNA的提取及RT-PCR：

采用苯酚－氯仿法提取黃粉蟲總RNA，用SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒以提取的黃粉蟲總RNA為模板進行體外反轉錄擴增，以合成的cDNA為模板進行PCR反應；PCR在25μL體系中進行，2μLcDNA模板，2.5μL25mMMg²⁺，2.5μLdNTP，2.5μL10×聚合酶緩沖液，0.5μL5U/μLTaq聚合酶，2μL上下游引物；反應程序如下:94℃預變性3min；94℃變性30s，51℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環；最后72延伸10min.PCR產物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察特異性條帶的出現，以判斷克隆的重組結果；

Tenecin基因原核表達載體的構建：

將RT-PCR產物回收，連接于pET28a(+)載體，轉化E.coliDH-5a中，隨機挑取克隆進行質粒提取，PCR及KpnI和BamHⅠ雙酶切鑒定陽性克隆，PCR反應體系及反應條件同1.3所述；酶切體系20μl按說明書進行；陽性克隆進行測序再次驗證；

重組質粒pET28a(+)-Tenecin的轉化及誘導表達：

將陽性重組載體pET30a(+)-Tenecin轉化到原核表達菌株PBL121中；重組菌體均勻涂布到LB固體培養基上，37℃培養10h；挑取單克隆于LB液體培養基，250r/min、37℃過夜培養，按照1∶100的比例進行擴大培養至D600＝0.5～0.6，加入終濃度為1mmol/L的IPTG進行誘導，250r/min、37℃培養約4h，12000r/min、30s離心收集菌體，進行12.5％的SDS-PAGE電泳，并用考馬斯亮藍染液進行染色鑒定靶蛋白是否成功表達；

表達產物的純化：

將陽性菌株按1％的接種量接種于200mL的LB培養基，含終濃度為50μg/mL的Kan中的大量誘導表達靶蛋白，37℃氣浴振蕩培養至OD600＝0.6～0.8后，取出1mL未誘導的菌液做為對照，然后加入終濃度為1mmol/LIPTG誘導表達4h；然后用50mL離心管分裝菌液，置于高速冷凍離心機下4℃4000rpm離心10min，收集菌體，用20mL預冷的

1×BindingBuffer(0.5mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl,5mmol/Limidazole,pH7.9)重懸菌體；在冰上超聲破碎菌體，收集上清；上清液采用AKTApurify10系統純化回收；15％SDS-PAGE和Westernblotting檢測蛋白質純化效果；

表達蛋白抗病毒活性的檢測：

以5～6葉期的TMV枯斑寄主心葉煙為實驗對象，用ddH₂O將純化得到靶蛋白溶液稀釋到終濃度為10μg/ml，然后與等體積的TMV病毒液混合，靜置0.5h；同體積的ddH2O與TMV病毒液混合實驗對照；采用半葉枯斑法檢測靶蛋白抗病毒活性。

本發明的有益效果在于：