[發明專利]抗病毒活性物質Tenecin活性肽的研制實驗方法

在審

• 申請號: 201711098811.X
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN107916272A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 陳偉;景曉雅;樊澤璐;李佳;郭瑞珍;蘭徐智斌;王祎玲
• 申請（專利權）人: 山西師范大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62;C12Q1/18
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種抗病毒活性物質Tenecin活性肽的研制實驗方法，其特征在于：包括實驗材料：選擇50～60日齡黃粉蟲幼蟲，放置在長29cm寬21.5cm高7cm塑料盆中，一周投喂一次精料，一天投喂一次青料，在溫度26℃、濕度60％恒定環境中飼養；

引物：根據GenBank公布的黃粉蟲Tenecin基因序列設計特異引物，

上游引物為：5'-GGGGTACCATGCACGAGATCACGATG-3'，

下游引物：5'-CGGGATCCCTAGACCCTCTTTCCGTT-3'，

并引入KpnI和BamHⅠ酶切位點，擴增片段長度為252bp；

黃粉蟲RNA的提取及RT-PCR：

采用苯酚－氯仿法提取黃粉蟲總RNA，用SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒以提取的黃粉蟲總RNA為模板進行體外反轉錄擴增，以合成的cDNA為模板進行PCR反應；PCR在25μL體系中進行，2μLcDNA模板，2.5μL25mMMg²⁺，2.5μLdNTP，2.5μL10×聚合酶緩沖液，0.5μL5U/μLTaq聚合酶，2μL上下游引物；反應程序如下:94℃預變性3min；94℃變性30s，51℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環；最后72延伸10min.PCR產物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察特異性條帶的出現，以判斷克隆的重組結果；

Tenecin基因原核表達載體的構建：

將RT-PCR產物回收，連接于pET28a(+)載體，轉化E.coliDH-5a中，隨機挑取克隆進行質粒提取，PCR及KpnI和BamHⅠ雙酶切鑒定陽性克隆，PCR反應體系及反應條件同1.3所述；酶切體系20μl按說明書進行；陽性克隆進行測序再次驗證；

重組質粒pET28a(+)-Tenecin的轉化及誘導表達：

將陽性重組載體pET30a(+)-Tenecin轉化到原核表達菌株PBL121中；重組菌體均勻涂布到LB固體培養基上，37℃培養10h；挑取單克隆于LB液體培養基，250r/min、37℃過夜培養，按照1∶100的比例進行擴大培養至D600＝0.5～0.6，加入終濃度為1mmol/L的IPTG進行誘導，250r/min、37℃培養約4h，12000r/min、30s離心收集菌體，進行12.5％的SDS-PAGE電泳，并用考馬斯亮藍染液進行染色鑒定靶蛋白是否成功表達；

表達產物的純化：

將陽性菌株按1％的接種量接種于200mL的LB培養基，含終濃度為50μg/mL的Kan中的大量誘導表達靶蛋白，37℃氣浴振蕩培養至OD600＝0.6～0.8后，取出1mL未誘導的菌液做為對照，然后加入終濃度為1mmol/LIPTG誘導表達4h；然后用50mL離心管分裝菌液，置于高速冷凍離心機下4℃4000rpm離心10min，收集菌體，用20mL預冷的

1×BindingBuffer(0.5mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl,5mmol/Limidazole,pH7.9)重懸菌體；在冰上超聲破碎菌體，收集上清；上清液采用AKTApurify10系統純化回收；15％SDS-PAGE和Westernblotting檢測蛋白質純化效果；

表達蛋白抗病毒活性的檢測：

以5～6葉期的TMV枯斑寄主心葉煙為實驗對象，用ddH₂O將純化得到靶蛋白溶液稀釋到終濃度為10μg/ml，然后與等體積的TMV病毒液混合，靜置0.5h；同體積的ddH2O與TMV病毒液混合實驗對照；采用半葉枯斑法檢測靶蛋白抗病毒活性。