[發明專利]一種黃酒酒體蛋白質的二維電泳樣品的制備方法

有效

• 申請號: 201711098470.6
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN107722105B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 孫軍勇;陸健;齊小慧;謝廣發
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K1/30
• 分類號: C07K1/30;C07K1/26;G01N1/28
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種黃酒酒體蛋白質的二維電泳樣品的制備方法，屬于黃酒檢測技術領域。本發明提供的方法將黃酒樣品的pH被調節至8.5，打開了多糖與蛋白之間結合的鍵，同時，將酒液中的多糖優先沉淀析出，通過離心作為雜質去除，避免了對雙向電泳的干擾。接著采用0.1M的乙酸銨?甲醇溶液沉淀酒液中的蛋白質，將其他干擾雙向電泳的雜質留在了上清液中，是本發明制備黃酒酒體蛋白質二維電泳的樣品制備方法的關鍵。

技術領域

本發明涉及一種黃酒酒體蛋白質的二維電泳樣品的制備方法，屬于黃酒檢測技術領域。

背景技術

黃酒發展至今，消費者對其品質的要求越來越高，澄清的黃酒更容易被接受。然而蛋白混濁仍然是黃酒行業亟待解決的質量問題之一。黃酒中蛋白質、多糖、多酚、金屬離子等物質的存在使混濁機理相對復雜，但根據目前的研究結果，認為蛋白質是引起黃酒非生物混濁的主要原因。在黃酒的沉淀物中，蛋白質占有較大的比例，一般在50％左右。

黃酒樣品中含有大量非淀粉多糖和淀粉多糖，以及金屬離子。市售瓶裝黃酒一般至少陳釀3年以上才會銷售，因此很多黃酒蛋白在長期的陳釀過程中與多糖形成糖蛋白，影響了雙向電泳時蛋白的分離效果。

而黃酒酒體蛋白質，尤其是黃酒沉淀樣品的二維電泳樣品的制備是研究其化學組成、分子結構特征及在儲藏和運輸過程中發生沉淀機理的先決條件。因此，瓶裝黃酒蛋白質二維電泳的樣品制備方法對研究和最終解決黃酒蛋白質混濁問題就顯得非常重要。發明人采用飽和硫酸銨沉淀酒體蛋白時，發現只有少量蛋白質沉淀出來；采用TCA-丙酮沉淀時，發現在沉淀酒體蛋白質的同時，多糖等其他的雜質也同時沉淀出來，影響了雙向電泳圖譜中蛋白質的分離。

發明內容

本發明的目的是為了解決目前現有技術中存在的上述不足，提供了一種黃酒酒體蛋白質二維電泳的樣品制備方法。

所述方法包括如下步驟：

(1)取一定體積黃酒樣品，加入1.0-2.0g/L的氯化鈣，調pH至8.5，4℃冰箱過夜。

(2)0-4℃下，8000-10000g離心20-30min，將所得上清液用PEG 20000包埋截留分子量為3500Da的透析膜濃縮10倍。

(3)將濃縮后的酒液過脫鹽柱，例如Sephacryl G25柱脫鹽。向脫鹽后的酒樣中加入5倍體積0.1M的乙酸銨-甲醇溶液，置于﹣20℃冰箱中沉淀兩小時以上。4℃下，12000g離心30min，收集沉淀。用-18—-20℃預冷的甲醇洗滌沉淀二次。

(4)將所得沉淀置于室溫下10-15min，使甲醇全部揮發。將沉淀用水化液溶解，控制蛋白濃度在1mg/mL左右，進行雙向電泳。

步驟(1)中黃酒樣品的pH被調節至8.5，pH調節劑為氫氧化鈉或氫氧化鉀。pH被調節至8.5既可以打開多糖與蛋白之間結合的鍵，同時，酒液中的多糖沉淀析出，通過離心去除，避免了對雙向電泳的干擾。

步驟(2)中，所述透析膜的截留分子量為3500Da。黃酒酒液中的蛋白分子量普遍偏小，采用截留分子量為3500Da的透析膜，最大程度地避免了黃酒酒體蛋白質在樣品制備過程中的損失。

步驟(3)中，向脫鹽后的酒液中加入的沉淀酒體蛋白的試劑為0.1M的乙酸銨-甲醇溶液，體積為酒液體積的5倍。0.1M的乙酸銨-甲醇溶液優先沉淀酒液中的蛋白質，將其他干擾雙向電泳的雜質留在了上清液中，是本發明制備黃酒酒體蛋白質二維電泳的樣品制備方法的關鍵。

本發明的有益效果：

本發明將黃酒樣品的pH被調節至8.5，這樣既可以打開多糖與蛋白之間結合的鍵，同時，酒液中的多糖沉淀析出，通過離心去除，避免了對雙向電泳的干擾。接著采用0.1M的乙酸銨-甲醇溶液沉淀酒液中的蛋白質，將其他干擾雙向電泳的雜質留在了上清液中，是本發明制備黃酒酒體蛋白質二維電泳的樣品制備方法的關鍵。