[發明專利]一種基于雙Aptamer夾心結構開啟環介導等溫擴增的凝血酶檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201711096321.6
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN107794295B
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 張何;蔣序春;傅昕
• 申請（專利權）人: 湖南工程學院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/56
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明一種基于雙Aptamer夾心結構開啟環介導等溫擴增的凝血酶檢測方法和檢測試劑盒。將雙Aptamer夾心結構與LAMP初級基礎結構混合，在Nb.BsrDI切刻內切酶作用下形成LAMP基礎結構，在引物的作用下進行環介導等溫擴增，在擴增產物中加入血紅素，利用ABTS?H₂O₂反應進行凝血酶的檢測；所述雙Aptamer夾心結構的3’端帶有一條游離單鏈序列，引發環介導等溫擴增。本發明還提供了上述方法的試劑盒。本發明首次將雙Aptamer夾心檢測法、環介導等溫擴增技術以及G?四鏈體?血紅素DNA酶酶促反應結合起來，是一種高靈敏度、高特異性的凝血酶檢測新方法。

技術領域

本發明涉及生物學檢測技術領域，涉及一種基于環介導等溫擴增信號放大技術和核酸適配體識別技術的凝血酶檢測方法及試劑盒。

背景技術

凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，也是血液凝血級聯反應中的主要效應蛋白酶，顯現出促凝和抗凝的特性。當循環凝血因子在暴露的血管外組織與組織因子相接觸時，凝血酶會在組織上聚集。凝血酶不但參與凝血過程，還作為一種重要的細胞外信號分子，通過激活凝血酶受體，參與一系列病理過程，如：裂解纖維蛋白原形成纖維蛋白血栓，激活血小板。因此發展具有實用價值的凝血酶高靈敏檢測方法對于醫學臨床診斷具有重要意義。

具有較強應用價值的檢測技術需要三個方面的特征：特異性、高靈敏及低成本。凝血酶的特異性識別技術包括抗體識別和分子適配體識別(Aptamer)，高靈敏檢測使用的信號放大方法有滾環擴增、鏈置換等溫擴增、雜交鏈式反應及樹狀結構、納米技術、G-四鏈體擴增等，信號來源主要包括熒光信號、電化學信號及化學發光等。近年來在此基礎上已經發展了大量的凝血酶檢測技術(Biosens Bioelectron.2014，56，71–76；BiosensBioelectron.2018，99，338-345；Biosens Bioelectron.2016，80，463-470；Analyst.2015，140(22)，7710-7717；Chem Commun.2015，51(37)，7927-30；Biosens Bioelectron.2015，66，423-430)，這些方法有較好的特異性、靈敏性等優點，但同時也存在較大的缺陷，如依賴大型儀器、信號獲取需要特殊標記導致成本高等缺點。

環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種全新的核酸擴增方法，該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備可實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。環介導等溫擴增主要用于生物方面微生物的檢測，機理是檢測其核酸，此方法只能檢測核酸，適用性范圍較窄。

發明內容

本發明提供了一種基于雙Aptamer夾心結構開啟環介導等溫擴增的凝血酶檢測方法及試劑盒，將核酸適配體識別、環介導等溫擴增技術有機結合起來，形成了一種用于凝血酶檢測的高性能生物傳感技術。

本發明的技術方案如下：

本發明提供了一種基于雙Aptamer夾心結構開啟環介導等溫擴增的凝血酶檢測方法，所述雙Aptamer夾心結構包括親和素修飾的微球載體和負載在所述微球載體上生物素化的凝血酶雙Aptamer夾心結構，所述雙Aptamer夾心結構的3’端帶有一條游離單鏈序列，引發環介導等溫擴增；

將所述雙Aptamer夾心結構與LAMP初級基礎結構混合；所述LAMP初級基礎結構具有游離的3’突出末端，所述3’突出末端序列與所述雙Aptamer夾心結構的3’端游離單鏈序列互補；所述LAMP初級基礎結構的3’突出末端序列還帶有Nb.BsrDI切刻內切酶的切割位點；

在Nb.BsrDI切刻內切酶作用下，所述雙Aptamer夾心結構與LAMP初級基礎結構結合并切割形成LAMP基礎結構；