[發明專利]一種基于雙Aptamer夾心結構開啟環介導等溫擴增的凝血酶檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201711096321.6
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN107794295B
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 張何;蔣序春;傅昕
• 申請（專利權）人: 湖南工程學院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/56
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

1.一種基于雙Aptamer夾心結構開啟環介導等溫擴增的凝血酶非疾病診斷目的的檢測方法，其特征在于，所述雙Aptamer夾心結構包括親和素修飾的微球載體和負載在所述微球載體上生物素化的凝血酶雙Aptamer夾心結構，所述雙Aptamer夾心結構的3’端帶有一條游離單鏈序列，引發環介導等溫擴增；

將所述雙Aptamer夾心結構與LAMP初級基礎結構混合；所述LAMP初級基礎結構具有游離的3’突出末端，所述3’突出末端序列與所述雙Aptamer夾心結構的3’端游離單鏈序列互補；所述LAMP初級基礎結構的3’突出末端序列還帶有Nb.BsrDI切刻內切酶的切割位點；

在Nb.BsrDI切刻內切酶作用下，所述雙Aptamer夾心結構與LAMP初級基礎結構結合并切割形成LAMP基礎結構；

所述LAMP基礎結構在引物的作用下進行環介導等溫擴增，所述引物中至少包括一條含有G-四鏈體序列互補序列的引物，得到含有G-四鏈體序列的擴增產物；

將所述擴增產物與血紅素混合，所述擴增產物中的DNA序列經解旋折疊后，形成G-四鏈體-血紅素DNA酶，利用ABTS-H₂O₂反應進行凝血酶的檢測；

所述LAMP初級基礎結構由探針P3-1和探針P3-2同時與探針P3-COM互補結合，在Ampligase連接酶的作用下構建得到；

其中，所述探針P3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探針P3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述探針P3-COM的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述LAMP初級基礎結構的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述環介導等溫擴增使用4條引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.7～10所示。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述凝血酶雙Aptamer夾心結構中包括核酸適配體P1和核酸適配體P2，所述核酸適配體P1為生物素修飾的核酸適配體，固定在所述微球載體上，所述核酸適配體P2的3’端帶有一條游離單鏈序列，所述核酸適配體P1與所述核酸適配體P2分別與凝血酶特異性結合形成雙Aptamer夾心結構。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述核酸適配體P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述核酸適配體P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述LAMP初級基礎結構的構建條件為在90～98℃的溫度下反應10～50s，再于30～40℃溫度下反應5～10min，在上述條件下進行20～40個循環反應。

6.一種用于凝血酶檢測的試劑盒，包括親和素修飾微球、生物素化的核酸適配體P1、核酸適配體P2、凝血酶；探針P3-1、探針P3-2、探針P3-COM、Ampligase連接酶、Nb.BsrDI切刻內切酶、引物FIP、引物BIP、引物FLP-G4、引物BLP-G4、Bst DNA聚合酶、緩沖液、ABTS和H₂O₂；

所述生物素化的核酸適配體P1、核酸適配體P2、探針P3-1、探針P3-2和探針P3-COM的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1～5所示；

所述引物FIP、引物BIP、引物FLP-G4、引物BLP-G4的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.7～10所示。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述緩沖液包括Binding/wash緩沖液、BSA TB buffer、reactionbuffer、NEBuffer2.1緩沖液和LAMP等溫擴增緩沖液。