[發明專利]一種活性蟲草酵素的制備方法

有效

• 申請號: 201711096208.8
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN108085303B
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 賀曉軍
• 申請（專利權）人: 杭州惠博士生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N1/14;A61K8/9728;A61K8/66;A61Q19/08;A61Q19/02;A61Q19/00;C12R1/645
• 代理公司: 杭州凱知專利代理事務所(普通合伙) 33267
• 代理人: 金國棟

1.一種活性蟲草酵素的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

1)液體培養基的選擇

液體培養基成分按照重量比，組成如下：

a、碳源10-20％，

b、氮源10-20％，

c、無機鹽為K₂HPO₄和M_gSO₄·7H₂O，K₂HPO₄為0.04-0.1％，M_gSO₄·7H₂O為0.01-0.07％，

d、其他為VB1，透明質酸和去離子水，VB1為0.002-0.005％，透明質酸0.2-0.5％，去離子水補到100％；

2)蟲草菌種的移植和保藏

移植培養的操作過程，將加了凝固劑的液體培養基pH值調到6.0，滅菌后傾斜放入無菌操作臺得到斜面固體培養基，冷卻后接種蟲草菌種，接種后的試管放入恒溫培養箱中，在25℃下培養7d；保藏，菌種放在4℃－6℃冰箱內避光保存，移植前保藏期為2-3個月；移植培養，將蟲草菌種轉接到新配制的斜面固體培養基中，重復上述操作；

3)蟲草菌種的接種

按照步驟1)中的液體培養基成分配制1000g液體培養基，裝于帶側臂管的三角燒瓶內，滅菌冷卻到室溫后從斜面固體培養基中取出面積為1-3cm²的塊狀蟲草菌苔，接入液體培養基中；

4)蟲草菌種的搖床上培養

將步驟3中接入液體培養基中的蟲草菌種，在24-26℃的恒溫震蕩培養箱中以轉速為120-150r/min避光培養68-72h，期間pH控制在5.0-7.0；

5)蟲草菌種的擴大發酵

將步驟1配制好的液體培養基倒入發酵罐，原位滅菌25-35min，降溫后，迅速將步驟4中搖床上培養得到的蟲草菌種培養液倒入發酵罐中，開始擴大發酵；設置發酵溫度24℃～26℃，轉速120-150r/min，培養8-12h后通氣，通氣量1.5-1.8v/v·min，避光培養1～2天，期間pH控制在5.0-7.0,制得活性蟲草酵素發酵液。

2.如權利要求1所述的活性蟲草酵素的制備方法，其特征在于，還包括步驟6)蟲草酵素活性成分檢測，

將上述步驟5)發酵后制得的活性蟲草酵素發酵液置于離心機中，以3000-4500r/min的轉速離心15-30min，收集發酵上清液，對發酵上清液用孔徑為0.22μm中空纖維微濾系統進行微濾，收集發酵濾過液，再分別用基質固相分散提取法測定蟲草素、分級沉淀法測定蟲草SOD含量、苯酚-硫酸法測定蟲草多糖含量、乙醇-微波協同提取法測定蟲草酸含量及基質固相分散提取法測定核苷類物質含量。

3.如權利要求1所述的活性蟲草酵素的制備方法，其特征在于，所述液體培養基組成成分中碳源為葡萄糖、馬鈴薯其中之一；氮源為蛋白胨、胡蘿卜、蠶蛹其中之一。

4.如權利要求1所述的活性蟲草酵素的制備方法，其特征在于，所述透明質酸為3-10個雙糖單位、分子量在1000-4000D的小分子透明質酸寡糖片段。

5.如權利要求1或3所述的活性蟲草酵素的制備方法，其特征在于，所述液體培養基為：

葡萄糖10.0-20.0g，蛋白胨5.0-15.0g，透明質酸2.0-5.0g，K₂HPO₄ 0.4-1.0g，M_gSO₄·7H₂O 0.1-0.7g，VB1 0.02-0.05g，余下去離子水補到1000g。

6.如權利要求5所述的活性蟲草酵素的制備方法，其特征在于，所述液體培養基組成成分中葡萄糖為20g，所述蛋白胨為15g，所述K₂HPO₄為1g，所述M_gSO₄·7H₂O為0.5g，所述VB1為0.05g，所述透明質酸為5g，余下去離子水補到1000g。

7.如權利要求1或2所述的活性蟲草酵素的制備方法，其特征在于，所述菌種保藏中移植時間3個月，所述接種量取3cm²的塊狀蟲草菌苔，所述步驟4中接入液體培養基中的蟲草菌種搖床培養時間為72h，步驟5擴大發酵過程中所述蟲草菌種擴大深層液體培養10h后通氣，通氣量為1.8v/v·min。