[發明專利]一種擴張性+肥厚性心肌病易感基因的檢測方法及芯片

在審

• 申請號: 201711094223.9
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN109762879A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發明（設計）人: 葛均波;李華;楊旭
• 申請（專利權）人: 葛均波;李華;楊旭
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C40B50/06;C12Q1/686;C40B40/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種擴張性+肥厚性心肌病易感基因的檢測方法，其特征在于，包括：

S1.將待檢測基因組DNA打斷，主帶為300-400bp；

S2.將打斷的DNA片段進行純化、末端修復、加接頭并進行PCR擴增；

S3.將擴增產物與目標區域捕獲芯片進行雜交，擴增、純化后得到目標DNA測序文庫；

S4.使用測序文庫進行測序，得到目前基因上的序列；

S5.使用測序序列進行生物信息學分析，包括序列質量控制、序列比對、比對文件預處理以及檢測SNP、Indel變異、變異過濾和注釋；

S6.對變異結果進行解讀，并分為致病、疑似致病、意義未明、疑似良性、良性5類；

其中，檢測過程中要求測序數據量達到0.4Gb以上，測序深度達到500X，覆蓋度高于99.9％。

2.根據權利要求1所述擴張性+肥厚性心肌病易感基因的檢測方法，其特征在于，在S1中，具體包括：取1μg基因組DNA移入1.5ml EP管，補足ddH2O至60μl；將樣品用超聲破清洗器破碎，破碎條件：片段(bp)：180，水深(cm)：4+(0.5)，時間(s)：600，其中：若基因組有降解，則需適當減少打斷時間；每打斷一個樣品需將泡沫板放入冰水中冷卻；取2μl破碎后的DNA，2％瓊脂糖凝膠電泳100V 30min進行驗證，直至主帶在300-400bp范圍內為止。

3.根據權利要求2所述擴張性+肥厚性心肌病易感基因的檢測方法，其特征在于，在S2中，具體包括：

VAHTS DNA clean Beads純化：渦旋混勻VAHTS DNA clean Beads，并室溫孵育30min備用；按樣品數準備好干凈的1.5ml離心管，加入60μL重懸好的VAHTS DNA clean Beads，并將對應的編號寫好,將上一步的DNA破碎產物加入準備好的beads內，并用槍頭混勻,室溫孵育5min；如管壁上有液體可瞬時離心，置于磁力架上，靜置5min；待溶液清亮后，用槍頭小心吸取丟棄上清液；加入200μL 80％乙醇漂洗，于磁力架上靜置30s，用槍頭小心吸取丟棄上清液；重復前次步驟一次，瞬時離心后，使用10μL槍頭吸凈離心管底部殘留的液體；室溫干燥5min讓乙醇盡量揮發干凈；加入52.5μL ddH2O，渦旋混勻，瞬時離心，置于磁力架上，靜置5min，準備PCR管，并將編號寫好，用槍頭小心吸取50.5μl上清液到準備好的PCR管內，吸1μl測定Qubit；

末端修復：按如下配置末端修復和加A的反應體系：Fragmented DNA 42μL，Buffer 16.8μL，Enzyme 1 1.6μL，總計50μL；輕柔混勻，瞬時離心，按如下在PCR儀上進行反應：37℃30min，72℃30min，4℃Hold；反應結束后立刻放置冰上，立即進入下一步接頭連接反應；

接頭連接反應：按如下所示配置Adaptor Ligation反應體系：Buffer 2-1 8.4μL，buffer 2-2 15μL，enhancer 1.6μL，小片段接頭4μL，Enzyme 2 1μL，總計79.4μL；輕柔充分混勻，瞬時離心，按如下所示在PCR儀上進行反應：20℃70min，4℃Hold；

VAHTS DNA clean Beads純化：渦旋混勻VAHTS DNA clean Beads；并室溫孵育30min備用；按樣品數準備好干凈的1.5ml離心管，加入93.5μL重懸好的VAHTS DNA clean Beads，并將對應的編號寫好；將上一步的連接產物加入準備好的beads內，并用槍頭混勻，室溫孵育5min；

如管壁上有液體可瞬時離心，置于磁力架上，靜置5min；待溶液清亮后，用槍頭小心吸取丟棄上清液；加入200μL 80％乙醇漂洗，于磁力架上靜置30s；用槍頭小心吸取丟棄上清液；重復前次步驟一次，瞬時離心后使用10μL槍頭吸凈離心管底部殘留的液體；室溫干燥5min讓乙醇盡量揮發干凈；加入31μL ddH2O，渦旋混勻，瞬時離心，置于磁力架上，靜置5min；準備PCR管，并將編號寫好；用槍頭小心吸取30μl上清液到準備好的PCR管內；

Size Selection及切膠回收：2％的瓊脂糖凝膠電泳，100V，電泳70min；凝膠電泳切取含目標片段的凝膠塊，切膠范圍240-340bp。；稱膠重，加6倍凝膠體積Buffer QG，50℃溶膠10min，每2-3min混勻一次；膠完全溶解后，加1倍凝膠體積的異丙醇和10ul的PH＝5.2的3M醋酸鈉緩沖液混勻；將QIAquick spin column置于2ml收集管中，加入溶膠液，室溫靜置5min，4,000rpm離心1min去除濾液；加0.5ml Buffer QG到QIAquick spin column中4,000rpm離心1min，去除濾液；加0.75ml Buffer PE到QIAquick spin column中4,000rpm離心1min，去除濾液，重復一次；12,000rpm空甩2min；將QIAquick spin column轉入新的EP管中，室溫晾干5min；加入26ul洗脫液，室溫靜置4min，12,000rpm離心1min，收集到的DNA全部用于下一步的PCR反應；

PCR Enrichment：按照如下所示配置PCR Enrichment反應體系：Adaptor Ligated DNAFrag ments 24μL，KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)25μL，Indexed Primer Mix(25uM)1μL，總計50μL；瞬時離心，將所有液體收集到PCR管底；按照如下所示，將上述PCR管放入PCR儀中運行擴增程序：98℃30s，98℃10s循環4次，65℃30s循環4次，72℃30s循環4次，72℃5min，4℃Hold；反應完成后，將PCR管拿出，瞬時離心，將所有液體收集到管底，用XP磁珠進行純化；

Purify the PCR Products：渦旋混勻VAHTS DNA clean Beads，室溫孵育30min備用；按樣品數準備好干凈的1.5mL離心管，加入50μL重懸好的VAHTS DNA clean Beads；將上一步PCR產物加入準備好的VAHTS DNA clean Beads內，并用槍頭混勻，室溫孵育5min；瞬時離心，將所有液體收集到管底。置于磁力架上，靜置5min；待溶液清亮后，用槍頭小心吸取丟棄上清液；加入200μL 80％乙醇，上下顛倒磁力架2-3次，徹底漂洗DNA，靜置30s，用槍頭小心吸取丟棄上清液；重復前次步驟一次；瞬時離心，將所有殘留乙醇收集到管底，用10μL槍頭吸取離心管底部殘留的液體；敞開蓋子5min，讓乙醇盡量揮發干凈，至磁珠干燥；加入20μLddH2O，輕輕彈勻，徹底重懸磁珠，室溫放置5min；瞬時離心，置于磁力架上，靜置5min；待溶液清亮后，用10μL槍頭小心吸取20μL上清至干凈的離心管內為預制備文庫。

4.一種擴張性+肥厚性心肌病易感基因的檢測芯片，其特征在于，基于如上述權利要求3所述的檢測方法實現。